Diferència clau: PCR vs seqüenciació d'ADN
PCR i seqüenciació d'ADN són dues tècniques importants en biologia molecular. La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és el procés que crea un gran nombre de còpies d'un fragment d'ADN. La seqüenciació de l'ADN és la tècnica que dóna com a resultat l'ordre precís dels nucleòtids d'un fragment d'ADN determinat. Aquesta és la diferència clau entre la PCR i la seqüenciació d'ADN. La PCR és un dels principals passos implicats en la seqüenciació de l'ADN.
Què és la PCR?
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica d'amplificació d'ADN utilitzada en biologia molecular. Produeix entre milers i milions de còpies d'un fragment d'ADN concret. Aquest mètode va ser desenvolupat per Kary Mullis l'any 1983. En aquesta tècnica, el fragment d'ADN que s'ha d'amplificar serveix com a plantilla i l'enzim ADN polimerasa afegeix nucleòtids complementaris al cebador que està disponible a la barreja de PCR. Al final de la reacció de PCR, es sintetitzen moltes còpies de la mostra d'ADN.
Hi ha diferents components de la barreja de PCR, com ara l'ADN, l'ADN polimerasa (Taq polimerasa), els cebadors (cebadors directes i inversos), els nucleòtids (blocs de construcció de l'ADN) i un tampó. La PCR es fa dins d'una màquina de PCR i s'ha de carregar la barreja correcta de PCR a la màquina i s'ha de conduir el programa correcte. Aquesta tècnica permet produir de milers a milions de còpies d'una secció concreta d'ADN a partir d'una quantitat molt petita d'ADN.
Les reaccions PCR es produeixen de manera cíclica per produir la quantitat visible de productes de PCR en un gel. Hi ha tres passos principals implicats en una reacció de PCR, és a dir, la desnaturalització, el recuit del primer i l'extensió de cadena, tal com es mostra a la figura 01. Aquests tres passos es produeixen a tres temperatures diferents. L'ADN existeix en forma de doble cadena per enllaços d'hidrogen entre les bases complementàries. Abans de la implicació, l'ADN de doble cadena s'ha de separar l'un de l' altre. Es fa donant una temperatura alta. A alta temperatura, l'ADN de doble cadena es desnaturalitza en cadenes simples. Aleshores, els cebadors haurien d'apropar-se als extrems flanquejants del fragment específic o del gen de l'ADN. El primer és un tros curt d'ADN monocatenari que és complementari a la seqüència diana. Els cebadors directes i inversos s'acumulen amb les bases complementàries als extrems flanquejants de la mostra d'ADN desnaturalitzada a la temperatura de recuit. Les imprimacions han de ser resistents a la calor. Una vegada que els cebadors s'alimenten amb l'ADN de la mostra, l'enzim taq polimerasa inicia la síntesi de les noves cadenes afegint nucleòtids que són complementaris a l'ADN objectiu. La polimerasa Taq és un enzim termoestable aïllat d'un bacteri termòfil anomenat Thermus aquaticus. El tampó de PCR manté les condicions òptimes per a l'acció de la polimerasa taq. Aquestes tres etapes de les reaccions de PCR es repeteixen per produir la quantitat necessària de producte de PCR. Després de cada reacció de PCR, el nombre de còpies d'ADN es duplica. Per tant, es pot observar una amplificació exponencial a la PCR. Els productes de PCR es poden observar mitjançant electroforesi en gel i es poden purificar per a estudis posteriors.
Figura 01: passos principals d'una reacció de PCR
PCR és una eina valuosa en investigació mèdica i biològica. La PCR té un valor especial en la ciència forense, ja que pot amplificar l'ADN per a estudis a partir de mostres minúscules dels delinqüents i fer perfils d'ADN forense. La PCR s'utilitza àmpliament en moltes àrees de la biologia molecular, com ara genotipat, clonació de gens, detecció de mutacions, seqüenciació d'ADN, microarrays d'ADN i proves de paternitat, etc.
Figura 02: Reacció en cadena de la polimerasa
Què és la seqüenciació d'ADN?
La seqüenciació de l'ADN és la determinació d'un ordre precís dels nucleòtids: adenina, guanina, citosina i timina en un fragment d'ADN determinat. La informació genètica s'emmagatzema a les seqüències d'ADN utilitzant l'ordre correcte dels nucleòtids. Per tant, trobar l'ordre precís dels nucleòtids en un fragment d'ADN és molt important per conèixer l'estructura i la funció dels gens.
El protocol de seqüenciació d'ADN implica diferents processos. El primer pas és aïllar l'ADN interessat o l'ADN genòmic d'un organisme. Utilitzant PCR (com es descriu anteriorment), s'ha d'amplificar la regió desitjada de l'ADN. El producte de PCR amplificat s'ha de separar mitjançant l'electroforesi en gel i purificat. Els fragments amplificats es serveixen com a plantilles per a la seqüenciació. La seqüenciació es pot fer seguint la seqüenciació de Sanger o el mètode de seqüenciació d' alt rendiment. La seqüenciació de Sanger requereix electroforesi capil·lar dels fragments d'ADN resultants. La determinació de l'ordre correcte dels nucleòtids es pot fer mitjançant la lectura manual d'autorradiografies o mitjançant seqüenciadors d'ADN automatitzats.
La seqüenciació de gens va contribuir al projecte del genoma humà i va facilitar el mapeig del genoma humà l'any 2003. En medicina forense, la seqüenciació d'ADN va permetre la identificació d'individus que mostren seqüències d'ADN úniques i identifiquen els criminals. En medicina, la seqüenciació de l'ADN es pot utilitzar per detectar els gens responsables de mal alties genètiques i altres, trobar gens defectuosos i substituir-los per gens correctes. En l'agricultura, la informació de seqüenciació d'ADN d'alguns microorganismes s'utilitza per produir cultius transgènics amb les característiques econòmicament desitjades.
Figura 03: Seqüenciació d'ADN
Quina diferència hi ha entre la PCR i la seqüenciació d'ADN?
PCR vs seqüenciació d'ADN |
|
| El procés PCR crea entre milers i milions de còpies del fragment d'ADN interessat. | La seqüenciació d'ADN és el procés de determinar l'ordre precís dels nucleòtids en un fragment d'ADN determinat. |
| Resultat | |
| PCR crea de milers a milions de còpies d'un fragment d'ADN concret | Això dóna lloc a l'ordre correcte de les bases en un fragment d'ADN concret. |
| Implicació de ddNTPs | |
| PCR no requereix ddNTP. Utilitza dNTP. | La seqüenciació d'ADN requereix ddNTP per acabar amb la formació de cadena. |
Resum: PCR vs seqüenciació d'ADN
PCR i la seqüenciació d'ADN són eines molt importants en moltes àrees de la biologia molecular. L'amplificació dels fragments d'ADN es fa mitjançant la tècnica de PCR mentre que l'ordre correcte dels nucleòtids d'un fragment d'ADN es determina mitjançant la seqüenciació de l'ADN. Aquesta és la diferència entre la PCR i la seqüenciació d'ADN.
