Diferència clau: seqüenciació Maxam Gilbert vs Sanger
Els nucleòtids són les unitats estructurals bàsiques i els blocs de construcció de l'ADN. La molècula d'ADN està formada per una cadena de polinucleòtids. Hi ha quatre nucleòtids diferents que es troben a l'ADN. Aquests nucleòtids estan formats per quatre bases nitrogenades diferents anomenades A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina). L'ordre dels nucleòtids en la molècula d'ADN té una gran importància ja que codifica una important informació genètica per al creixement i desenvolupament dels organismes. La seqüenciació de l'ADN fa referència al procés que determina la seqüència precisa de nucleòtids de l'ADN. Hi ha diferents mètodes de seqüenciació d'ADN. La seqüenciació de Maxam Gilbert i la seqüenciació d'ADN de Sanger són dos mètodes de seqüenciació d'ADN que pertanyen a la seqüenciació de primera generació. El procediment de seqüenciació de Maxam Gilbert determina la seqüència de bases escindant químicament els fragments d'ADN marcats amb l'extrem 5' preferentment a cadascun dels quatre nucleòtids i l'electroforesi en gel. El procediment de seqüenciació de Sanger determina la seqüència de nucleòtids mitjançant la síntesi d'ADN monocatenari mitjançant ADN polimerasa i didesoxinucleòtids i electroforesi en gel. Aquesta és la diferència clau entre Maxam Gilbert i Sanger Sequencing.
Què és la seqüenciació de Maxam Gilbert?
La seqüenciació de Maxam Gilbert, també coneguda com a mètode de seqüenciació química, és una tècnica que es va desenvolupar per determinar l'ordre dels nucleòtids de l'ADN. Aquest mètode va ser introduït per W alter Gilbert i Alan Maxam el 1976 i es va fer popular ja que es pot realitzar directament amb ADN purificat. El mètode Maxam Gilbert pertany a la primera generació de seqüenciació d'ADN, i va ser el primer mètode de seqüenciació utilitzat àmpliament pels científics.
El principi bàsic d'aquest mètode rau en la restricció dels fragments d'ADN marcats a l'extrem en bases específiques per substàncies químiques i condicions específiques de la base i la separació dels fragments marcats per electroforesi tal com es mostra a la figura 01. Els fragments es separen segons a les seves mides al gel. Com que els fragments estan etiquetats, la seqüència de la molècula d'ADN es pot deduir fàcilment.
El mètode Maxam Gilbert utilitza substàncies químiques específiques de base per trencar l'ADN en bases específiques. S'utilitzen dos productes químics comuns anomenats sulfat de dimetil i hidrazina per atacar selectivament les purines i les pirimidines, respectivament.
El mètode de seqüenciació de Maxam Gilbert es realitza mitjançant diversos passos de la següent manera.
- Purificació de la seqüència d'ADN mitjançant endonucleases de restricció
- Etiquetatge dels extrems dels fragments d'ADN afegint fosfats radioactius
- Purificació dels fragments marcats a partir de fragments no marcats mitjançant electroforesi en gel
- Separació de l'ADN marcat a l'extrem en quatre tubs i tractament amb substàncies químiques específiques de base per separat
- Electroforesi del contingut de cada tub en línies separades sobre un gel i separació de fragments segons la seva longitud.
- Detecció dels fragments per autorradiografia.
Figura 01: seqüenciació de Maxam Gilbert
Què és la seqüenciació de Sanger?
La seqüenciació Sanger és un mètode de seqüenciació desenvolupat per Frederick Sanger i els seus col·legues el 1977 per determinar la seqüència de bases d'un fragment d'ADN determinat. També es coneix com a seqüenciació de terminació de cadena o mètode de seqüenciació dideoxi. Aquest mètode funciona sobre el principi d'incorporació selectiva de didesoxinucleòtids de terminació de cadena (ddNTPs) com ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP per part de l'ADN polimerasa durant la síntesi d'ADN monocatenari per acabar la formació de cadena. Els didesoxinucleòtids no tenen grups OH 3' per a la formació d'enllaços fosfodièster amb el nucleòtid adjacent. Per tant, la formació de cadena s'atura un cop s'incorpora un ddNTP a la cadena de nova formació durant la seqüenciació de sanger.
En aquest mètode, es realitzen quatre reaccions de síntesi d'ADN (PCR) separades en quatre tubs separats amb un tipus de ddNTP. També s'ofereixen altres requisits per als tubs per a la PCR, incloent primers, dNTPs, polimerasa Taq, condicions específiques, etc. Es realitzen quatre reaccions separades en quatre tubs amb quatre mescles. Després de les reaccions de PCR, els fragments d'ADN resultants es desnaturalitzen per calor i se separen mitjançant electroforesi en gel. A continuació, els fragments es visualitzen utilitzant un imprimador marcat (radioactiu o fluorescent) o dNTP, tal com es mostra a la figura 02.
Figura 02: seqüenciació de Sanger
Quina diferència hi ha entre Maxam Gilbert i Sanger Sequencing?
Seqüenciació de Maxam Gilbert vs Sanger |
|
| La seqüenciació de Maxam Gilbert és la primera tècnica desenvolupada per a la seqüenciació d'ADN. | El mètode de seqüenciació Sanger es va introduir després del mètode de seqüenciació Maxam Gilbert. |
| Ús | |
| Aquest mètode s'utilitza poques vegades. | La seqüenciació Sanger s'utilitza habitualment per a la seqüenciació. |
| Ús de productes químics perillosos | |
| Utilitza productes químics perillosos. | L'ús de productes químics perillosos és limitat en comparació amb el mètode Maxam Gilbert. |
| Etiquetatge per a la detecció | |
| Aquest mètode utilitza P32 radioactiu per etiquetar els extrems dels fragments d'ADN. | La seqüenciació de Sanger utilitza ddNTP marcats de manera radioactiva o fluorescent. |
Resum: Maxam Gilbert vs Sanger Seqüenciació
La seqüenciació de Maxam Gilbert i Sanger són dos tipus de tècniques de seqüenciació d'ADN que s'incorporen a la seqüenciació d'ADN de primera generació. La seqüenciació de Maxam Gilbert és el primer mètode introduït per a la seqüenciació d'ADN l'any 1976, i es realitza trencant els fragments d'ADN marcats a l'extrem mitjançant substàncies químiques específiques de bases. Per tant, es coneix com a seqüenciació química. El mètode de seqüenciació de Sanger es va introduir el 1977 i es basa en les reaccions de terminació en cadena impulsades per ddNTP. Mètode de seqüenciació Sanger popular que el mètode Maxam Gilbert a causa de diversos desavantatges del mètode Maxam Gilbert, com ara el consum excessiu de temps, l'ús de productes químics perillosos, etc. Aquesta és la diferència entre la seqüenciació de Maxam Gilbert i Sanger.
