Diferència clau: seqüenciació Sanger vs piroseqüenciació
La seqüenciació de l'ADN és molt important per a l'anàlisi de l'ADN, ja que el coneixement de la disposició correcta dels nucleòtids en una regió concreta d'ADN revela molta informació important al respecte. Hi ha diferents mètodes de seqüenciació d'ADN. La seqüenciació de Sanger i la piroseqüenciació són dos mètodes diferents de seqüenciació d'ADN àmpliament utilitzats en biologia molecular. La diferència clau entre la seqüenciació de Sanger i la piroseqüenciació és que la seqüenciació de Sanger utilitza didesoxinucleòtids per acabar la síntesi d'ADN per llegir la seqüència de nucleòtids mentre que la piroseqüenciació detecta l'alliberament de pirofosfat incorporant els nucleòtids i sintetitzant la seqüència complementària per llegir l'ordre precís de la seqüència.
Què és la seqüenciació de Sanger?
La seqüenciació Sanger és un mètode de seqüenciació d'ADN de primera generació desenvolupat per Frederick Sanger i els seus col·legis l'any 1977. També es coneix com a seqüenciació de terminació de cadena o seqüenciació dideoxi, ja que es basa en la terminació de la cadena per dideoxinucleòtids (ddNTP). Aquest mètode es va utilitzar àmpliament durant més de 30 anys fins que es va desenvolupar la seqüenciació de nova generació (NGS). La tècnica de seqüenciació de Sanger va permetre el descobriment de l'ordre de nucleòtids correcte o la fixació d'un fragment d'ADN particular. Es basa en la incorporació selectiva de ddNTPs i la terminació de la síntesi d'ADN durant la replicació de l'ADN in vitro. L'absència de grups OH 3' per continuar la formació d'enllaços fosfodièster entre nucleòtids adjacents és una característica única dels ddNTPs. Per tant, un cop connectat el ddNTP, l'allargament de la cadena cessa i acaba des d'aquest punt. Hi ha quatre ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP) utilitzats en la seqüenciació de Sanger. Aquests nucleòtids aturen el procés de replicació de l'ADN quan s'incorporen a la cadena creixent d'ADN i donen lloc a longituds variables d'ADN curt. L'electroforesi en gel capil·lar s'utilitza per organitzar aquestes cadenes curtes d'ADN segons les seves mides en un gel, tal com es mostra a la figura 01.
Figura 1: electroforesi en gel capil·lar d'ADN curt sintetitzat
Per a la replicació in vitro de l'ADN, s'han de proporcionar pocs requisits. Són l'enzim ADN polimerasa, l'ADN plantilla, els cebadors d'oligonucleòtids i els desoxinucleòtids (dNTP). En la seqüenciació de Sanger, la replicació de l'ADN es realitza en quatre tubs d'assaig separats juntament amb quatre tipus de ddNTP per separat. Els desoxinucleòtids no es substitueixen totalment pels respectius ddNTP. Una barreja del dNTP particular (per exemple; dATP + ddATP) s'inclou al tub i es replica. Quatre productes de tubs separats s'executen sobre un gel en quatre pous separats. Llegint el gel, es pot construir la seqüència tal com es mostra a la figura 02.
Figura 02: seqüenciació de Sanger
La seqüenciació de Sanger és una tècnica important que ajuda en moltes àrees de la biologia molecular. El projecte del genoma humà es va completar amb èxit amb l'ajuda dels mètodes basats en la seqüenciació de Sanger. La seqüenciació de Sanger també és útil en la seqüenciació d'ADN objectiu, la investigació del càncer i mal alties genètiques, l'anàlisi d'expressió gènica, la identificació humana, la detecció de patògens, la seqüenciació microbiana, etc.
Hi ha diversos desavantatges de la seqüenciació de Sanger:
- La longitud de l'ADN que s'està seqüenciant no pot superar els 1.000 parells de bases
- Només es pot seqüenciar un fil alhora.
- El procés requereix molt de temps i és costós.
Per tant, amb el temps es van desenvolupar noves tècniques avançades de seqüenciació per superar aquests problemes. Tanmateix, la seqüenciació de Sanger encara s'està utilitzant a causa dels seus resultats altament precisos fins a uns 850 fragments de longitud de parells de bases.
Què és la piroseqüenciació?
Pyrosequencing és una nova tècnica de seqüenciació d'ADN basada en la "seqüenciació per síntesi". Aquesta tècnica es basa en la detecció de l'alliberament de pirofosfat després de la incorporació de nucleòtids. El procés és emprat per quatre enzims diferents: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa i apirasa i dos substrats adenosina 5' fosfosulfat (APS) i luciferina.
El procés comença amb la unió de l'encebador amb la plantilla d'ADN monocatenari i l'ADN polimerasa inicia la incorporació de nucleòtids complementaris a aquesta. Quan els nucleòtids s'uneixen (polimerització d'àcids nucleics), allibera grups de pirofosfat (dos grups fosfat units) i energia. Cada addició de nucleòtids allibera una quantitat equimolar de pirofosfat. El pirofosfat es converteix en ATP per l'ATP sulfurilasa en presència del substrat APS. L'ATP generat impulsa la conversió mediada per luciferasa de luciferina a oxiluciferina, produint llum visible en quantitats que són proporcionals a la quantitat d'ATP. La llum la detecta un dispositiu de detecció de fotons o un fotomultiplicador i crea un pirograma. L'apirasa degrada l'ATP i els dNTP no incorporats a la barreja de reacció. L'addició de dNTP es fa una vegada. Com que l'addició de nucleòtids es coneix segons la incorporació i detecció de llum, es pot determinar la seqüència de la plantilla. El pirograma s'utilitza per generar la seqüència de nucleòtids de la mostra d'ADN tal com es mostra a la figura 03.
La piroseqüenciació és molt important en l'anàlisi del polimorfisme d'un sol nucleòtid i la seqüenciació de trams curts d'ADN. L' alta precisió, la flexibilitat, la facilitat d'automatització i el processament paral·lel són els avantatges de la piroseqüenciació respecte a les tècniques de seqüenciació de Sanger.
Figura 03: Piroseqüenciació
Quina diferència hi ha entre la seqüenciació Sanger i la piroseqüenciació?
Seqüenciació Sanger vs Piroseqüenciació |
|
| La seqüenciació de Sanger és un mètode de seqüenciació d'ADN basat en la incorporació selectiva de ddNTP mitjançant la DNA polimerasa i la terminació de la cadena. | La piroseqüenciació és un mètode de seqüenciació d'ADN basat en la detecció de l'alliberament de pirofosfats després de la incorporació de nucleòtids. |
| Ús de ddNTP | |
| Els ddNTP s'utilitzen per acabar la replicació de l'ADN | No s'utilitzen ddNTP. |
| Enzims implicats | |
| S'utilitzen ADN polimerasa. | S'utilitzen quatre enzims: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa i apirasa. |
| substrats utilitzats | |
| APS i Luciferina no s'utilitzen. | S'utilitzen fosfosulfat d'adenosina 5' (APS) i luciferina. |
| Temperatura màxima | |
| Aquest és un procés lent. | Aquest és un procés ràpid. |
Resum: seqüenciació Sanger vs piroseqüenciació
La seqüenciació Sanger i la piroseqüenciació són dos mètodes de seqüenciació d'ADN utilitzats en biologia molecular. La seqüenciació de Sanger construeix l'ordre dels nucleòtids en seqüència acabant l'allargament de la cadena mentre que la piroseqüenciació construeix l'ordre precís dels nucleòtids en seqüència mitjançant la incorporació de nucleòtids i la detecció de l'alliberament de pirofosfats. Per tant, la diferència principal entre la seqüenciació de Sanger i la piroseqüenciació és que la seqüenciació de Sanger funciona amb la seqüenciació per terminació de cadena mentre que la piroseqüenciació funciona amb la seqüenciació per síntesi.
