Diferència clau: seqüenciació NGS vs Sanger
La seqüenciació de nova generació (NGS) i la seqüenciació Sanger són dos tipus de tècniques de seqüenciació de nucleòtids desenvolupades al llarg del temps. El mètode de seqüenciació Sanger es va utilitzar àmpliament durant molts anys i NGS el va substituir recentment a causa dels seus avantatges. La diferència clau entre NGS i la seqüenciació de Sanger és que NGS treballa sobre el principi de seqüenciar milions de seqüències simultàniament de manera ràpida a través d'un sistema de seqüenciació, mentre que la seqüenciació de Sanger treballa en el principi de la terminació de la cadena a causa de la incorporació selectiva de didesoxinucleòtids per l'enzim ADN polimerasa. durant la replicació de l'ADN i la separació de fragments resultant per electroforesi capil·lar.
Què és la seqüenciació de nucleòtids?
La informació genètica s'emmagatzema a les seqüències de nucleòtids de l'ADN o ARN d'un organisme. El procés de determinar l'ordre correcte dels nucleòtids (utilitzant quatre bases) en un fragment determinat (en un gen, un grup de gens, un cromosoma i un genoma complet) es coneix com a seqüenciació de nucleòtids. És molt important en estudis genòmics, estudis forenses, virologia, sistemàtica biològica, diagnòstic mèdic, biotecnologia i en molts altres camps analitzar l'estructura i la funció dels gens. Hi ha diferents tipus de mètodes de seqüenciació desenvolupats pels científics. Entre ells, la seqüenciació de Sanger desenvolupada per Frederick Sanger l'any 1977 va ser àmpliament utilitzada i popularitzada durant molt de temps fins que la seqüenciació de nova generació la va substituir.
Què és NGS?
La seqüenciació de nova generació (NGS) és un terme que s'utilitza per referir-se als processos moderns de seqüenciació d' alt rendiment. Descriu diverses tecnologies modernes de seqüenciació que van revolucionar els estudis genòmics i la biologia molecular. Aquestes tècniques són la seqüenciació Illumina, la seqüenciació Roche 454, la seqüenciació de protons iònics i la seqüenciació SOLiD (seqüenciació per detecció de lligadura d'oli). Els sistemes NGS són més ràpids i econòmics. En els sistemes NGS s'utilitzen quatre mètodes principals de seqüenciació d'ADN, a saber; piroseqüenciació, seqüenciació per síntesi, seqüenciació per lligament i seqüenciació de semiconductors d'ions. Es pot seqüenciar paral·lelament un gran nombre de cadenes d'ADN o ARN (milions de). Permet la seqüenciació de tot el genoma dels organismes en un període de temps curt, a diferència de la seqüenciació de Sanger, que requereix més temps.
NGS té molts avantatges respecte al mètode Sanger de seqüenciació convencional. És un procés d' alta velocitat, més precís i rendible que es pot realitzar amb una mida de mostra petita. NGS es pot utilitzar en estudis metagenòmics, en la detecció de variacions dins d'un genoma individual a causa d'insercions i supressions, etc. i en l'anàlisi d'expressions gèniques.
Figura_1: Evolució de la seqüenciació NGS
Què és la seqüenciació de Sanger?
La seqüenciació Sanger és un mètode de seqüenciació desenvolupat per Frederick Sanger i els seus col·legues el 1977 per determinar l'ordre precís dels nucleòtids d'un fragment d'ADN determinat. També es coneix com a seqüenciació de terminació de cadena o seqüenciació didesoxi. El principi de funcionament d'aquest mètode és la terminació de la síntesi de cadena mitjançant la incorporació selectiva d'un didesoxinucleòtid de terminació de cadena (ddNTPs) com ara ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP per part de l'ADN polimerasa durant la replicació de l'ADN. Els nucleòtids normals tenen grups OH 3' per a la formació d'un enllaç fosfodièster entre nucleòtids adjacents per continuar la formació de la cadena. Tanmateix, els ddNTP no tenen aquest grup OH 3' i són incapaços de formar enllaços fosfodièster entre nucleòtids. Per tant, s'atura l'allargament de la cadena.
En aquest mètode, l'ADN monocatenari que s'ha de seqüenciar serveix com a cadena de plantilla per a la síntesi d'ADN in vitro. Altres requisits són el cebador oligonucleòtid, els precursors desoxinucleòtids i l'enzim ADN polimerasa. Quan es coneixen els extrems flanquejants del fragment objectiu, els cebadors es poden dissenyar fàcilment per a la replicació de l'ADN. Es realitzen quatre reaccions de síntesi d'ADN separades en quatre tubs separats. Cada tub té ddNTP separats, juntament amb altres requisits. A partir del nucleòtid particular, s'afegeix una barreja de dNTPs i ddNTPs. Així mateix, es realitzen quatre reaccions separades en quatre tubs amb quatre mescles. Després de les reaccions, es realitza la detecció de fragments d'ADN i la conversió del patró de fragments en informació de seqüència. Els fragments d'ADN resultants es desnaturalitzen per calor i se separen mitjançant electroforesi en gel. Si s'utilitzen nucleòtids radioactius, el patró de bandes al gel de poliacrilamida es pot visualitzar mitjançant autorradiografia. Quan aquest mètode utilitza els didesoxinucleòtids etiquetats fluorescentment, es pot mitigar pel gel llegit i passar per un feix de làser per ser detectat pel detector fluorescent. Per evitar errors que podrien sorgir quan una seqüència es llegeix a l'ull i s'introdueix manualment en un ordinador, aquest mètode es va desenvolupar en l'ús d'un seqüenciador automàtic combinat amb l'ordinador.
Aquest és el mètode utilitzat per seqüenciar l'ADN del projecte Genoma humà. Aquest mètode encara s'està utilitzant amb modificacions avançades perquè proporciona informació de seqüència precisa tot i ser un procés car i lent.
Figura_2: seqüenciació de Sanger
Quina diferència hi ha entre la seqüenciació NGS i Sanger?
NGS vs Seqüenciació Sanger |
|
| La seqüenciació de nova generació (NGS) fa referència als processos moderns de seqüenciació d' alt rendiment. Descriu una sèrie de tecnologies de seqüenciació modernes diferents | La seqüenciació Sanger és un mètode de seqüenciació desenvolupat per Frederick Sanger per determinar l'ordre precís dels nucleòtids d'un fragment d'ADN determinat. |
| Rentabilitat | |
| NGS és un procés més barat perquè redueix el temps, la força humana i els productes químics. | Aquest procés és costós perquè requereix temps, força humana i més productes químics. |
| Velocitat | |
| Això és més ràpid, ja que tant la detecció química com la detecció del senyal de moltes cadenes es fan paral·leles. | Això requereix molt de temps, ja que la detecció química i la detecció del senyal es produeixen com a dos processos separats i només es poden llegir a la cadena alhora. |
| Fiabilitat | |
| NGS és fiable. | La seqüenciació de Sanger és menys fiable |
| Mida de la mostra | |
| NGS requereix menys quantitat d'ADN. | Aquest mètode necessita una gran quantitat d'ADN de plantilla. |
| Bases d'ADN per fragment seqüenciat | |
| El nombre de bases d'ADN per fragment seqüenciat és inferior al mètode Sanger | Les seqüències de generació són més llargues que les seqüències NGS. |
Resum: seqüenciació NGS vs Sanger
NGS i la seqüenciació de Sanger són tècniques de seqüenciació de nucleòtids molt utilitzades en biologia molecular. La seqüenciació Sanger és un mètode de seqüenciació primerenc que va ser substituït per NGS. La diferència principal entre NGS i Sanger Sequencing és que NGS és un procés d' alta velocitat, més precís i rendible que la seqüenciació Sanger. Ambdues tècniques van crear brots importants en genètica i biotecnologia.
