Diferència clau: cebadors de PCR i cebadors de seqüenciació
Amb els recents desenvolupaments en el camp de la biologia molecular, es van desenvolupar diferents tècniques genètiques que van fer fàcils i precisos els processos d'investigació de diferents vies del tema. La PCR i altres procediments de seqüenciació són dues tècniques importants. Utilitzen diferents subcomponents. Els primers es consideren el subcomponent principal comú tant a les tècniques de PCR com de seqüenciació. Els cebadors de PCR s'utilitzen per a l'amplificació d'una seqüència d'ADN particular, mentre que els cebadors de seqüenciació s'utilitzen en el context de la seqüenciació d'un fragment d'ADN amb la intenció de revelar el seu ordre específic de la seqüència de nucleòtids. Aquesta és la diferència clau entre els cebadors de PCR i els cebadors de seqüenciació.
Què són els primers PCR?
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica genètica que s'utilitza en el camp de la biologia molecular per amplificar una o poques còpies d'un determinat segment d'ADN i obtenir molts milions de còpies idèntiques. En una reacció de PCR, s'utilitzen diferents components, inclosos els primers. Els cebadors són cadenes d'ADN curtes amb una longitud de nucleòtids de 18-25 que els fan compatibles amb la regió inicial i final dels fragments d'ADN que s'han d'amplificar. Els imprimadors poden ser un imprimador directe i un imprimador invers. Aquests cebadors s'uneixen al fragment d'ADN en els punts específics on fa que l'ADN polimerasa s'uneixi al cebador específic a la ubicació i iniciï la síntesi de la nova cadena d'ADN.
La selecció dels primers és un aspecte important del procés de PCR. La selecció de la longitud de la imprimació és important. La longitud ideal seria de 18-25 nucleòtids. Si la longitud és massa curta o massa llarga, els cebadors no s'uniran a la seqüència d'ADN per amplificar-se amb precisió. Els cebadors que tenen una longitud massa curta condueixen a un recuit de cebadors inespecífics en diferents ubicacions de la seqüència d'ADN.
Figura 01: primers PCR
El contingut de guanina i citosina (GC) en una bona imprimació hauria d'estar entre 40 i 60. La temperatura de recuit de l'imprimació i la temperatura de fusió són factors vitals durant la PCR. La temperatura de fusió s'ha de calcular amb precisió i la temperatura de recuit de la imprimació ha de ser 5 0C inferior a la temperatura de fusió. La temperatura de fusió ha de ser de 60 °C i 75 °C. Les temperatures massa altes o massa baixes provocaran una activitat de la DNA polimerasa menys activa.
Què són els primers de seqüenciació?
Els cebadors de seqüenciació s'utilitzen en el context de la seqüenciació d'un fragment d'ADN amb la intenció de revelar la seva identitat específica. Per obtenir bons resultats de seqüenciació són importants imprimadors i plantilles d' alta qualitat. Per tant, quan es seleccionen els primers, haurien de ser únics per a una regió concreta on volem seqüenciar. També hauria de ser amb una orientació correcta on les seqüències es generen normalment des dels extrems 3’ a 5’ dels cebadors. La seqüència hauria de mancar d'auto-hibridació indesitjable, com ara la formació de bucles de forquilla. No ha de contenir formació consecutiva de bases de guanina.
La temperatura de fusió (Tm) de l'imprimació ha de ser adequada a les condicions de la seqüenciació. Per tant, hauria d'estar entre 52oC i 74oC. La preparació d'oligonucleòtids per utilitzar-los com a cebador s'ha de purificar per obtenir la longitud completa desitjada de la seqüència. Si els oligonucleòtids contenen impureses, la senyalització de la seqüència d'encebador es superposarà des de diferents llocs d'encebació i també disminuirà el nombre de cèl·lules base.
Figura 02: primers de seqüenciació
La temperatura de fusió de l'encebador (Tm) d'un oligonucleòtid determina la força que s'hibriditzen les cadenes d'ADN complementàries entre si. La Tm es pot considerar com un càlcul termodinàmic on depèn tant de seqüències d'ADN com de diverses condicions com la concentració de sal. La Tm és important durant la PCR on s'utilitza una variant anomenada seqüenciació del cicle per produir un grup de fragments acabats amb didesoxinucleòtids. Aquí, l'encebador que es seqüenciarà inicialment serà recuit alternativament, després s'estendrà i finalment es desnaturalitzarà per a l'amplificació. Per tant, el valor de Tm hauria d'estar entre 52oC i 74o C. Els oligonucleòtids sintetitzats es poden obtenir als laboratoris de síntesi d'ADN/ARN segons elecció. La petita escala de síntesi que s'utilitza per a la seqüenciació d'ADN sol ser de 50 nmol. També el més important és que els primers utilitzats per a la seqüenciació s'han de purificar perquè estiguin lliures d'impureses que evitaran la reducció de la qualitat.
Quines són les similituds entre els cebadors de PCR i els cebadors de seqüenciació?
- Tant els cebadors de PCR com els de seqüenciació són cebadors que s'utilitzen en el procés d'amplificació d'una seqüència d'ADN objectiu.
- Tant els cebadors de PCR com els de seqüenciació estan formats per nucleòtids.
- Tant els cebadors de PCR com els de seqüenciació són oligòmers curts.
Quina diferència hi ha entre els cebadors de PCR i els cebadors de seqüenciació?
Primadors de PCR versus cebadors de seqüenciació |
|
| Els cebadors de PCR són cadenes d'ADN curtes amb una longitud de seqüència de nucleòtids de 18-25 que els fan compatibles amb la regió inicial i final dels fragments d'ADN que s'han d'amplificar. | Els cebadors de seqüenciació són oligòmers curts que s'utilitzen en el context de la seqüenciació d'un fragment d'ADN amb la intenció de revelar la seva identitat específica. |
| Funció | |
| Els cebadors PCR s'utilitzen per a l'amplificació d'una seqüència d'ADN concreta. | Els cebadors de seqüenciació s'utilitzen en el context de la seqüenciació d'un fragment d'ADN amb la intenció de revelar la seva identitat específica. |
| Nombre d'imprimacions necessàries | |
| Dos imprimadors; un cebador directe i un cebador invers s'utilitzen com a cebadors de PCR. | Només cal un cebador com a cebador de seqüenciació. |
Resum: cebadors de PCR i cebadors de seqüenciació
Els cebadors de seqüenciació s'utilitzen en el context de la seqüenciació d'un fragment d'ADN amb la intenció de revelar la seva identitat específica. Una imprimació de seqüenciació serà suficient per executar el procés. Per obtenir bons resultats de seqüenciació, són importants primers i plantilles d' alta qualitat. Per tant, quan es seleccionen els primers, haurien de ser únics per a una regió concreta on volem seqüenciar. Els primers PCR són cadenes d'ADN curtes amb una longitud de nucleòtids de 18-25 que és compatible amb la regió inicial i final dels fragments d'ADN que s'han d'amplificar. Els cebadors de PCR poden ser un cebador directe i un cebador invers. El contingut de guanina i citosina (GC) en una bona imprimació hauria d'estar en el rang de 40-60. La temperatura de recuit de l'imprimació i la temperatura de fusió són aspectes vitals durant la PCR. Aquesta és la diferència entre els cebadors de PCR i els cebadors de seqüenciació.
