Diferència clau - Traducció de Nick vs Extensió de Primer
La traducció de Nick i l'extensió d'imprimació són dues tècniques importants que es realitzen en biologia molecular. La diferència clau entre la traducció del nick i l'extensió del primer és que el procés de traducció del nick produeix sondes marcades per a altres tècniques d'hibridació, mentre que el mètode d'extensió del primer identifica una seqüència d'ARN específica d'una barreja i revela informació sobre l'expressió d'ARNm. Ambdues tècniques tenen una gran importància i es realitzen habitualment en laboratoris d'investigació molecular.
Què és la traducció de Nick?
La traducció de Nick és una tècnica important que s'utilitza per preparar sondes marcades per a diverses tècniques biològiques moleculars com ara blotting, hibridació in situ, hibridació fluorescent in situ, etc. És un mètode in vitro d'etiquetatge d'ADN. Les sondes d'ADN s'utilitzen per identificar seqüències específiques d'ADN o ARN. Amb l'ajuda d'una sonda marcada, es poden marcar o visualitzar fragments específics a partir d'una barreja complexa d'àcid nucleic. Per tant, les sondes marcades es preparen utilitzant diverses tècniques per utilitzar-les per a diferents tècniques. La traducció de nick és un d'aquests mètodes que produeix sondes marcades amb l'ajuda dels enzims DNasa 1 i DNA polimerasa 1.
El procés de traducció de sobres comença amb l'activitat de l'enzim DNasa 1. La DNasa 1 introdueix entalls a la columna vertebral de fosfat de l'ADN de doble cadena mitjançant l'escissió dels enllaços fosfodièster entre nucleòtids. Un cop creat el nick, es produirà el grup 3' OH lliure del nucleòtid i l'enzim ADN polimerasa 1 actuarà sobre ell. L'activitat exonucleasa de 5' a 3' de l'ADN polimerasa 1 elimina els nucleòtids de l'encletxa cap a la direcció 3' de la cadena d'ADN. Simultàniament, l'activitat de la polimerasa de l'enzim ADN polimerasa 1 funciona i afegeix nucleòtids per substituir els nucleòtids eliminats. Si els nucleòtids estaven marcats, la substitució es produirà pels nucleòtids marcats i marcarà l'ADN per a la seva identificació. Aquest DNA marcat recentment sintetitzat es pot utilitzar com a sondes en diverses reaccions d'hibridació en Biologia Molecular.
Figura 01: procés de traducció de Nick
Què és Primer Extension?
L'extensió Primer és una tècnica que s'utilitza per trobar una seqüència d'ARN específica d'una barreja d'ARN i localitzar l'extrem 5' de la transcripció d'ARNm. També s'utilitza per estudiar l'estructura de l'ARN i l'expressió. El mètode d'extensió del primer es porta a terme amb cebadors marcats o amb nucleòtids marcats. Si s'utilitzen cebadors marcats, s'exclou la necessitat de marcar els nucleòtids que s'utilitzen per a la síntesi d'ADNc. Hi ha diversos passos en aquesta tècnica. Comença amb l'extracció d'ARN de la mostra. A continuació, s'afegeix un cebador oligonucleòtid marcat a la mescla juntament amb els ingredients necessaris per sintetitzar l'ADNc d'una seqüència d'ARN específica. El primer recuit amb la seqüència complementària de la mescla. Utilitzant la seqüència de recuit de l'encebador com a plantilla, l'enzim transcriptasa inversa sintetitza l'ADN complementari (ADNc) de la seqüència d'ARN. El recuit del primer i la transcripció inversa només es produeixen quan la seqüència específica d'ARN està present a la mostra. Finalment, quan es realitza l'electroforesi en gel desnaturalitzant, es pot determinar la mida de la seqüència d'ARN. També és fàcil trobar la base +1 de la seqüència d'ARNm (lloc d'inici de la transcripció) mitjançant el mètode d'extensió del primer. La quantitat d'ARNm present a la mostra es pot quantificar mitjançant aquest mètode si s'utilitza un excés d'imprimació.
Figura 02: extensió d'imprimació
Quina diferència hi ha entre Nick Translation i Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| La traducció de Nick és un procés que crea sondes d'ADN marcades per a diverses reaccions d'hibridació. | L'extensió Primer és una tècnica que s'utilitza per trobar ARN específic o per estudiar l'expressió gènica. |
| enzims utilitzats | |
| S'utilitzen DNasa 1 i enzims ADN polimerasa. | S'utilitza l'enzim transcriptasa inversa. |
| Importància | |
| La traducció de Nick facilita el marcatge d'una seqüència específica d'ADN. | L'extensió Primer permet la detecció de la mida específica de la seqüència d'ARNm i la quantitat present a la mostra. |
Resum – Traducció de Nick vs Extensió de Primer
La traducció de Nick és un mètode utilitzat per sintetitzar sondes marcades basades en les activitats dels enzims DNasa 1 i ADN polimerasa 1 d'E coli. És un mètode in vitro emprat als laboratoris previ a diferents tècniques d'hibridació. Durant la traducció del nick, l'activitat d'exonucleasa 5'-3' de l'ADN polimerasa 1 elimina els nucleòtids per davant del nick i l'activitat de la polimerasa de l'ADN polimerasa 1 substitueix els nucleòtids eliminats per nucleòtids marcats darrere del nick. L'extensió del primer és un mètode que s'utilitza per detectar una transcripció d'ARN específica d'una barreja i quantificar la mida i la quantitat de l'ARN d'interès. Aquesta és la diferència entre la traducció del sobrenom i l'extensió d'imprimació.
