Diferència clau: RT PCR vs QPCR
La reacció en cadena de la polimerasa és una tècnica utilitzada per amplificar una regió específica d'ADN in vitro. A causa de la invenció d'aquesta tècnica per Kary Mullis el 1983, els científics són capaços de fer milers o milions de còpies de fragments d'ADN específics amb finalitats d'investigació. Actualment s'ha convertit en una tècnica habitual i realitzada de manera rutinària en laboratoris clínics i d'investigació per a una àmplia varietat d'aplicacions. Hi ha variacions de la tècnica tradicional de PCR com ara RT PCR, PCR imbricada, PCR multiplex, Q PCR, RT – QPCR, etc. RT PCR i Q PCR són dues variacions importants de la PCR. La diferència clau entre RT PCR i Q PCR és que RT PCR s'utilitza per detectar l'expressió gènica mitjançant la creació de transcripcions complementàries d'ADN (cDNA) a partir d'ARN, mentre que Q PCR s'utilitza per mesurar quantitativament els productes de PCR en temps real mitjançant colorants fluorescents.
Què és RT PCR?
La reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT PCR) és una variant de la PCR que s'utilitza per detectar l'expressió d'ARN. És un mètode molt important per detectar l'expressió d'ARNm als teixits. RT PCR s'utilitza quan el material de partida de la mostra és l'ARN. En RT PCR, l'ARNm de plantilla es converteix primer en ADN complementari. Aquest pas és catalitzat per l'enzim transcriptasa inversa i el procés es coneix com a transcripció inversa. En segon lloc, la PCR tradicional s'utilitza per a l'ADNc recentment sintetitzat per a l'amplificació.
RT PCR és una tècnica molt sensible que requereix una quantitat relativament petita de mostra d'ARN. La RT PCR s'utilitza habitualment en el diagnòstic i la quantificació d'espècies d'ARN, especialment virus d'ARN com el virus de la immunodeficiència humana i el virus de l'hepatitis C.
Figura 01: Tècnica RT PCR
Què és QPCR?
La PCR quantitativa (QPCR) és una variant de la PCR que s'utilitza per mesurar quantitativament els productes de PCR. També es coneix com a reacció en cadena de la polimerasa en temps real, ja que mesura l'amplificació en temps real mitjançant una màquina de PCR en temps real. És un mètode adequat per determinar la quantitat d'una seqüència diana o gen present en una mostra. La característica interessant de QPCR és que combina l'amplificació i la quantificació real en un sol pas. Per tant, la necessitat d'electroforesi en gel en la detecció es pot eliminar mitjançant la tècnica QPCR. QPCR utilitza colorants fluorescents per etiquetar els productes de PCR durant les reaccions de PCR que finalment condueixen a la quantificació directa. Quan els productes de PCR s'acumulen, els senyals fluorescents també s'acumulen i seran mesurats per la màquina en temps real. QPCR es pot combinar amb RT PCR. Es coneix com RT – QPCR o QRT – PCR i es considera el mètode més potent, sensible i quantitatiu per a la detecció dels nivells d'ARN a les cèl·lules o teixits.
SYBR Green i Taqman són dos mètodes utilitzats per detectar o veure el procés d'amplificació de la PCR en temps real. El mètode SYBR Green es realitza mitjançant un colorant fluorescent anomenat SYBR green i detecta l'amplificació unint el colorant per produir ADN de doble cadena. Taqman es realitza mitjançant sondes de doble etiqueta i detecta l'amplificació per degradació de la sonda per part de la polimerasa Taq i l'alliberament del fluoròfor tal com es mostra a la figura 02. Ambdós mètodes controlen el progrés del procés d'amplificació i informen de la quantitat del producte en temps real..
La PCR en temps real té una gran varietat d'aplicacions com ara quantificació d'expressió gènica, anàlisi de microRNA i ARN no codificant, genotipat SNP, detecció de variants de nombre de còpies, detecció de mutacions rares, detecció d'organismes modificats genèticament, detecció d'agents infecciosos, etc.
Figura 02: tècnica de PCR quantitativa
Quina diferència hi ha entre RT PCR i QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR és una tècnica que s'utilitza per detectar l'expressió gènica per amplificació. | QPCR és una tècnica que amplifica l'ADN i quantifica els productes de PCR en temps real. |
| Implicació de l'enzim de la transcriptasa inversa | |
| La transcriptasa inversa enzimàtica s'utilitza per a RT PCR. | La transcriptasa inversa enzimàtica no s'utilitza per a la QPCR. |
| Ús de molècules marcades amb fluorescència | |
| Els colorants o sondes marcats amb fluorescència no s'utilitzen per a RT PCR. | S'utilitzen sondes o colorants marcats amb fluorescència per a la QPCR. |
| Quantificació del producte PCR | |
| Llevat que estigui combinat amb QPCR, RT PCR no quantifica el producte PCR. | QPCR mesura quantitativament el producte PCR. |
| Material inicial | |
| El material de partida és l'ARNm. | El material de partida és l'ADN. |
| Síntesi d'ADNc | |
| ADN complementari es produeix durant la RT PCR. | L'ADN complementari no es produeix durant la QPCR. |
Resum: RT PCR vs QPCR
RT PCR i QPCR són dues versions de la PCR tradicional. La tècnica RT PCR es realitza per a mostres d'ARNm i està impulsada per la transcripció inversa i la producció d'ADNc. QPCR s'utilitza per quantificar productes de PCR durant els cicles tèrmics de PCR en temps real mitjançant colorants fluorescents o sondes marcades. En QPCR, la quantitat de producte de PCR es representa pels senyals fluorescents emesos per la mostra. La RT PCR s'utilitza popularment com a procés d'amplificació, mentre que la QPCR s'utilitza habitualment com a procés de quantificació. Aquesta és la diferència entre RT PCR i QPCR.
