La diferència clau entre els assaigs convencionals de PCR imbricats i en temps real és que la PCR convencional és una tècnica desenvolupada per amplificar seqüències específiques d'ADN i la PCR niuada és una modificació de la PCR convencional que consisteix en dues reaccions d'amplificació seqüencials, mentre que reals. -time PCR és una variant de la PCR convencional que és capaç de quantificar el producte amplificat.
PCR és una tècnica científica molt comuna molt utilitzada en investigació i medicina per detectar l'ADN. Les proves de PCR s'utilitzen per detectar antígens detectant el seu ADN o ARN. Generalment, l'ARN viral està present al cos abans de detectar anticossos o mostrar els símptomes de la mal altia. Una prova de PCR pot dir si algú té o no el virus des del principi. Actualment, la PCR és la prova estàndard per detectar la mal altia COVID-19. Hi ha diferents tipus de tècniques de PCR, com ara PCR en temps real, PCR imbricada, PCR multiplex, PCR d'inici en calent i PCR de llarg abast, etc.
Què són els assaigs PCR convencionals?
L'assaig de PCR convencional és una tècnica d'amplificació d'ADN in vitro que es realitza habitualment en laboratoris de biologia molecular. Aquest mètode va permetre la producció de milers o milions de còpies d'un fragment d'ADN particular. Kary Mullis va introduir aquesta tècnica l'any 1980. Aquesta tècnica requereix un fragment d'ADN conegut com a plantilla per fer-ne moltes còpies. La Taq polimerasa funciona com l'enzim de l'ADN polimerasa i catalitza la síntesi de noves cadenes de la seqüència de plantilla.
Els imprimadors de la barreja de PCR funcionaran com a punts de partida per a les extensions de fragments. Tots els ingredients necessaris per fer còpies d'ADN s'inclouen a la barreja de PCR. La reacció de PCR s'executa en una màquina de PCR i s'ha d'alimentar amb la barreja de PCR correcta i el programa de PCR correcte. Si la barreja de reacció i el programa són correctes, produirà el nombre necessari de còpies d'una secció concreta d'ADN a partir d'una quantitat molt petita d'ADN.
Figura 01: assaig de PCR convencional
Hi ha tres passos principals implicats en una reacció de PCR: desnaturalització, recuit d'imprimació i extensió de cadena. Aquests tres passos es produeixen a tres temperatures diferents. El tampó de PCR manté les condicions òptimes per a l'acció de la polimerasa Taq. Aquestes tres etapes de la reacció de PCR es repeteixen per produir la quantitat necessària del producte de PCR. A cada reacció de PCR, el nombre de còpies d'ADN es duplica. Per tant, es pot observar una amplificació exponencial a la PCR. El producte de PCR es pot resoldre mitjançant electroforesi en gel, ja que produeix una quantitat visible d'ADN en un gel i es pot purificar per a estudis posteriors, com ara la seqüenciació.
PCR és una eina valuosa en investigació mèdica i biològica. Especialment en estudis forenses, la PCR té un valor immens, ja que pot amplificar l'ADN per a estudis a partir de mostres minúscules dels delinqüents i fer perfils d'ADN forenses. La PCR s'utilitza àmpliament en moltes àrees de la biologia molecular, com ara genotipat, clonació de gens, detecció de mutacions, seqüenciació d'ADN, microarrays d'ADN i proves de paternitat.
Què són els assaigs de PCR anidades?
La PCR niuada és un tipus de PCR que redueix l'amplificació inespecífica de l'ADN. Hi ha dues PCR successives o dues reaccions d'amplificació seqüencials en l'assaig de PCR niu. Durant la primera reacció d'amplificació, es produeix un producte de PCR. Després de la primera reacció, es realitza una segona reacció d'amplificació sobre el producte de PCR de la primera reacció. Per tant, els cebadors de la segona barreja de reacció s'uneixen amb el primer producte de PCR i l'amplifiquen.
Figura 02: PCR niu
Els parells d'imprimació són diferents en cada reacció. La unió inespecífica dels primers es redueix a la PCR niada. Els assajos de PCR nius són útils per augmentar la sensibilitat i/o l'especificitat. Tanmateix, la PCR imbricada requereix coneixements sobre la seqüència interessada.
Què són els assaigs de PCR en temps real?
PCR en temps real o PCR quantitativa (Q PCR) és una versió modificada de la PCR que mesura quantitativament els productes de PCR. Per tant, aquesta tècnica quantifica l'amplificació en temps real mitjançant una màquina de PCR en temps real. També és un mètode adequat per determinar la quantitat d'una seqüència diana o gen present en una mostra.
La característica interessant de la PCR en temps real és que combina l'amplificació i la quantificació real en un sol pas. Per tant, la necessitat d'electroforesi en gel per a la detecció es pot eliminar mitjançant la tècnica de PCR en temps real. L'ús de colorants fluorescents per etiquetar productes de PCR durant les reaccions de PCR eventualment conduirà a la quantificació directa. Quan s'acumulen els productes de PCR, també s'acumulen els senyals fluorescents i seran mesurats per la màquina en temps real. SYBR Green i Taqman són dos mètodes per detectar o veure el procés d'amplificació de la PCR en temps real. Tots dos mètodes controlen el progrés del procés d'amplificació i informen de la quantitat del producte en temps real.
Figura 03: PCR en temps real
La PCR en temps real té una gran varietat d'aplicacions com ara la quantificació d'expressió gènica, l'anàlisi de microRNA i ARN no codificant, genotipat SNP, detecció de variants de nombre de còpies, detecció de mutacions rares, detecció d'organismes modificats genèticament i detecció d'agents infecciosos.
Quines són les similituds entre els assaigs de PCR nius convencionals i en temps real?
- Els assaigs de PCR nidats i en temps real són modificacions dels assaigs de PCR convencionals.
- Les tres tècniques amplifiquen mostres d'ADN.
- Els seus productes es poden utilitzar en seqüenciació o anàlisi.
- Aquests assaigs requereixen cebadors.
Quina diferència hi ha entre els assaigs de PCR nius i en temps real convencionals?
La PCR convencional és una tècnica desenvolupada per amplificar seqüències específiques d'ADN. Mentrestant, la PCR anidada és una modificació de la PCR convencional que consta de dues reaccions d'amplificació seqüencials, i la PCR en temps real és una variant de la PCR convencional que és capaç de quantificar el producte amplificat. Per tant, aquesta és la diferència clau entre els assaigs de PCR nius convencionals i en temps real. A diferència de la PCR convencional i en temps real, la PCR imbricada utilitza dos conjunts d'imprimadors. A més, hi ha dues reaccions d'amplificació successives en la PCR imbricada per tal de reduir l'amplificació inespecífica. a més, els assaigs de PCR convencionals i en temps real no contenen dues reaccions d'amplificació seqüencials.
La següent infografia enumera les diferències entre els assaigs de PCR imbricats convencionals i en temps real en forma de taula per comparar-los.
Resum: assajos de PCR convencionals versus anidats i en temps real
La PCR convencional és la primera tècnica desenvolupada per amplificar fragments específics d'ADN. La PCR niuada i la PCR en temps real són dues variants de la PCR convencional. Hi ha dues reaccions d'amplificació seqüencials i l'ús de dos conjunts d'encebadors en la PCR imbricada. La PCR en temps real es desenvolupa per quantificar el producte de PCR amplificat. Així, això resumeix la diferència entre els assaigs de PCR nius convencionals i en temps real.
