Diferència clau: RAPD vs RFLP
En biologia molecular s'utilitzen marcadors genètics per identificar variacions genètiques entre individus i espècies. L'ADN polimòrfic amplificat aleatori (RAPD) i el polimorfisme de longitud de fragments de restricció (RFLP) són dos marcadors moleculars importants que s'utilitzen habitualment als laboratoris. La RAPD es realitza amb cebadors d'oligonucleòtids curts i arbitraris, i es basa en l'amplificació aleatòria de les múltiples localitzacions al llarg de l'ADN plantilla de l'organisme. La RFLP es realitza amb una endonucleasa de restricció específica i es basa en el polimorfisme dels fragments de restricció resultants i la hibridació. La diferència clau entre RAPL i RFLP és que la RAPD és un tipus de tècnica de PCR que es realitza sense el coneixement previ de la seqüència, mentre que RFLP no participa en la PCR i requereix coneixements previs de la seqüència per dur a terme la tècnica.
Què és RAPD?
RAPD és un marcador molecular útil en biologia molecular. És una tècnica fàcil i ràpida. La RAPD es pot definir com un mètode que dóna lloc a seqüències d'ADN polimòrfiques com a resultat de l'amplificació aleatòria de múltiples ubicacions de la plantilla d'ADN objectiu. RAPD utilitza cebadors oligonucleòtids curts amb seqüències arbitràries per a l'amplificació per PCR. Els primers es sintetitzen artificialment sense el coneixement previ de la seqüència. Per tant, es considera una tècnica fàcil i útil.
El RAPD inclou els passos principals següents.
- Extracció d'ADN objectiu
- Amplificació de les múltiples ubicacions de l'ADN objectiu mitjançant cebadors escollits aleatòriament
- Electroforesi en gel dels productes de PCR amplificats
- Tinció amb bromur d'etidi i identificació del polimorfisme
Com a resultat de la variació en el recuit de l'imprimació, durant l'amplificació es generen diferents fragments amb diferents longituds. Per tant, els patrons de bandes als gels són diferents entre individus i espècies. Així, la RAPD permet detectar la variació genètica entre organismes en la identificació i diferenciació.
RAPD s'aplica en diversos estudis de biologia molecular, com ara la identificació de la diferència genètica entre espècies estretament relacionades, mapes genètics, empremtes digitals d'ADN, identificació de mal alties hereditàries, etc.
Figura 01: RAPD
Què és RFLP?
Els polimorfismes de longitud de fragments de restricció (RFLP) són un marcador molecular utilitzat en biologia molecular per a la identificació de la variació genètica en seqüències d'ADN homòlogues. És el primer marcador genètic desenvolupat per a la presa d'empremtes digitals d'ADN. Tots els organismes produeixen perfils d'ADN únics quan estan restringits amb enzims de restricció específics. RFLP serveix com una eina important per produir perfils d'ADN únics d'individus i per detectar la variació genètica entre ells. Quan les mostres d'ADN es digereixen amb endonucleases de restricció específiques, es produeixen diferents perfils d'ADN que són únics per a cada individu. Per tant, el principal d'aquest mètode és la detecció de la variació genètica entre organismes restringint l'ADN homòleg amb enzims de restricció específics i l'anàlisi del polimorfisme de la longitud del fragment mitjançant electroforesi en gel i blotting. Els patrons d'absorció són únics per a cada organisme i caracteritzen els genotips específics.
Els passos següents estan relacionats amb RFLP.
- Aïllament d'una quantitat suficient d'ADN de les mostres
- Fragmentació de les mostres d'ADN amb endonucleases de restricció específiques en seqüència curta
- Separació dels fragments obtinguts amb diferents longituds mitjançant electroforesi en gel d'agarosa.
- Transferència del perfil de gel a una membrana mitjançant Southern blotting
- Hibridació de la membrana amb sondes marcades i anàlisi del polimorfisme de la longitud del fragment a cada perfil
RFLP té diverses aplicacions com ara diagnòstic de mal alties hereditàries, mapeig del genoma, identificació criminal en estudis forenses, proves de paternitat, etc.
Figura 02: genotipat RFLP
Quina diferència hi ha entre RAPD i RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD és un marcador molecular basat en cebadors aleatoris i PCR. | RFLP és un marcador molecular basat en la producció de diferents fragments de restricció de longitud. |
| Mostra obligatòria | |
| Mostres petites d'ADN són suficients per a l'anàlisi RAPD. | Es requereix una gran quantitat de mostra d'ADN extreta per a l'anàlisi RFLP. |
| Hora | |
| RAPD és un procés ràpid. | RFLP és un procés que requereix molt de temps. |
| Ús de la imprimació | |
| S'utilitzen imprimadors aleatoris i es poden utilitzar els mateixos imprimadors per a diferents espècies. | Les sondes específiques d'espècie s'utilitzen a RFLP per a la hibridació. |
| Fiabilitat | |
| La fiabilitat de la tècnica és menor en comparació amb RFLP. | RFLP és una tècnica fiable. |
| Blotting | |
| RAPD implica la transmissió sud. | Southern blotting és un pas d'RFLP. |
| Detecció de variació al·lèlica | |
| La RAPD no pot detectar les variacions al·lèliques. | Les variacions al·lèliques es poden detectar mitjançant RFLP. |
| Necessitat de coneixements de seqüències | |
| RAPD no requereix coneixements previs de seqüències. | Els coneixements previs de la seqüència són necessaris per dissenyar la sonda. |
| PCR | |
| PCR està involucrat amb RAPD | PCR no participa amb RFLP. |
| Reproducibilitat | |
| RAPD té una baixa reproductibilitat | RFLP té una alta reproductibilitat en comparació amb RAPD. |
Resum: RAPD vs RFLP
RAPD i RFLP són marcadors importants utilitzats en biologia molecular. Tots dos mètodes són capaços de detectar variacions genètiques entre organismes. La RAPD es realitza mitjançant cebadors aleatoris. RFLP es realitza mitjançant enzims de restricció específics. Tots dos mètodes produeixen perfils d'ADN únics per a organismes individuals. La RAPD implica uns quants passos comparables que RFLP. Però produeix resultats menys fiables i reproduïbles que RFLP. Aquesta és la diferència principal entre RAPD i RFLP.
