Diferència entre Northern Southern i Western Blotting

2024 Autora: Alex Aldridge | [email protected]. Última modificació: 2023-12-17 13:34

Diferència clau: Northern vs Southern vs Western Blotting

La detecció de seqüències específiques d'ADN, ARN i proteïnes és essencial per a diversos tipus d'estudis en biologia molecular. L'electroforesi en gel és una tècnica que separa l'ADN, l'ARN i les proteïnes segons les seves mides. A partir dels perfils de gel, es detecten seqüències particulars d'ADN, seqüències d'ARN o proteïnes mitjançant les tècniques especials anomenades blotting i hibridació amb sondes marcades. Hi ha tres tipus diferents de mètodes de borrat: el sud, el nord i l'oest. La diferència clau entre el blotting del nord del sud i l'oest rau en el tipus de molècula que detecta d'una mostra. Southern blotting és un mètode que detecta una seqüència específica d'ADN a partir d'una mostra d'ADN. Northern blotting és una tècnica que detecta una seqüència específica d'ARN a partir d'una mostra d'ARN. Western blotting és un mètode que detecta una proteïna específica d'una mostra de proteïna.

Què és Southern Blotting?

La tècnica Southern blotting va ser desenvolupada per E. M. Southern el 1975 per a la identificació d'una seqüència específica d'ADN a partir d'una mostra d'ADN. Aquesta és la primera tècnica de blotting introduïda en biologia molecular. Va permetre la detecció de gens específics de l'ADN, fragments específics d'ADN, etc. Hi ha diversos passos implicats en la tècnica de Southern Blotting. Són els següents.

1. L'ADNs'aïlla de la mostra i es digereix amb endonucleases de restricció.
2. La mostra digerida es separa mitjançant electroforesi en gel d'agarosa.
3. Els fragments d'ADN del gel es desnaturalitzen en cadenes simples mitjançant l'ús d'una solució alcalina.
4. El DNA monocatenari es transfereix a una membrana de filtre de nitrocel·lulosa mitjançant transferència capil·lar.
5. L'ADN transferit es fixa a la membrana permanentment.
6. El DNA fix a la membrana s'hibrida amb sondes marcades.
7. El DNA no lligat s'elimina de la membrana mitjançant el rentat.
8. La pel·lícula de raigs X s'exposa a la membrana i es prepara una autorradiografia.

Southern blotting s'aplica a diferents aspectes de la biologia molecular. És útil en cartografia RFLP, estudis forenses, metilació de l'ADN en l'expressió gènica, detecció de gens mutats en trastorns genètics, empremtes digitals d'ADN, etc.

Figura 01: Tècnica Southern Blotting

Què és Northern Blotting?

El Northern blotting és un mètode dissenyat per detectar una seqüència específica d'ARN o una seqüència d'ARNm d'una mostra per estudiar l'expressió gènica. Aquesta tècnica va ser desenvolupada per Alwine, Kemp i Stark l'any 1979. Es diferencia de les tècniques de blotting sourn i western a causa de diversos passos. Tanmateix, aquesta tècnica també es realitza mitjançant electroforesi en gel, blotting i hibridació amb sondes específiques marcades i detecció. La tècnica de Northern blotting es realitza de la següent manera.

1. ARN s'extreu de la mostra i se separa mitjançant electroforesi en gel.
2. ARN es transfereix del gel a una membrana de borrador i es fixa.
3. La membrana es tracta amb una sonda marcada preparada a partir d'ADNc o ARN (la sonda és complementària d'una seqüència específica de la mostra).
4. La sonda s'incuba amb la membrana per unir-se amb una seqüència específica.
5. Les sondes no vinculades es renten.
6. Un autorradiògraf detecta els fragments hibridats.

El Northern blotting és una eina important per a la detecció i quantificació de l'ARNm hibridat, l'estudi de la degradació de l'ARN, l'avaluació de la vida mitjana de l'ARN, la detecció de l'splicing d'ARN, l'estudi de l'expressió gènica, etc.

Figura 02: Northern Blotting

Què és Western Blotting?

Western blotting és un mètode per detectar una proteïna específica d'una barreja de proteïnes mitjançant l'ús d'anticossos marcats. Per tant, el western blot també es coneix com a immunoblot. Aquesta tècnica va ser introduïda per Towbin et al l'any 1979 i ara es realitza habitualment als laboratoris per a l'anàlisi de proteïnes. Els passos són els següents.

1. Les proteïnes s'extreuen de la mostra
2. Les proteïnes es separen per la seva mida mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida
3. Les molècules separades es transfereixen a una membrana de PVDF o membrana de nitrocel·lulosa per electroporació
4. La membrana està bloquejada per a la unió inespecífica amb els anticossos
5. Les proteïnes transferides s'uneixen amb anticossos primaris (anticossos marcats amb enzims).
6. La membrana es renta per eliminar els anticossos primaris lligats de manera no específica
7. Els anticossos units es detecten afegint un substrat i detectant el precipitat de color format

El Western blotting és útil per a la detecció d'anticossos anti-VIH en una mostra de sèrum humà. Western blot també es pot utilitzar com a prova de confirmació per a la infecció per hepatitis B i com a prova definitiva per a la mal altia de les vaques boges.

Figura 03: Western Blotting

Quina diferència hi ha entre Northern Southern i Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Tipus de molècula detectada
Northern Blotting	El Northern blotting detecta una seqüència d'ARN específica a partir d'una mostra d'ARN.
Southern Blotting	Southern blotting detecta una seqüència d'ADN específica a partir d'una mostra d'ADN.
Western Blotting	La transferència occidental detecta una proteïna específica d'una mostra de proteïna.
Tipus de gel
Northern Blotting	Això fa servir gel d'agarosa/formaldehid.
Southern Blotting	Això utilitza un gel d'agarosa.
Western Blotting	Això fa servir gel de poliacrilamida.
Mètode d'eliminació
Northern Blotting	Aquesta és una transferència capil·lar.
Southern Blotting	Aquesta és una transferència capil·lar.
Western Blotting	Aquesta és una transferència elèctrica.
sondes utilitzades
Northern Blotting	sondes d'ADNc o ARN marcades de manera radioactiva o no radioactiva.
Southern Blotting	Les sondes d'ADN estan marcades de manera radioactiva o no radioactiva.
Western Blotting	Els anticossos primaris s'utilitzen com a sondes.
Sistema de detecció
Northern Blotting	Això es fa mitjançant una autorradiografia o detecció de llum o canvi de color.
Southern Blotting	Això es fa mitjançant una autorradiografia, detecció de llum o canvi de color.
Western Blotting	Això es fa mitjançant la detecció de llum o canvi de color.

Resum - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting és una tècnica especial desenvolupada per a la identificació d'ADN, ARN o proteïnes específics de les mostres. Hi ha tres procediments de borrat separats, a saber, nord, sud i oest, per detectar un tipus específic de molècula. La tècnica de Northern blotting està dissenyada per detectar una seqüència específica d'ARN a partir d'una barreja d'ARN. La tècnica de Southern blotting permet la detecció d'una seqüència específica d'ADN a partir d'una mostra d'ADN i la tècnica de western blotting es desenvolupa per identificar una proteïna específica d'una barreja de proteïnes.