Diferència clau: SYBR Green vs Taqman
SYBR Green i Taqman són dos mètodes utilitzats per detectar o veure el procés d'amplificació de la PCR en temps real. SYBR Green és un mètode basat en la intercalació del colorant de tinció d'àcid nucleic mentre que Taqman és un mètode basat en la sonda d'hidròlisi. Ambdues tecnologies estan dissenyades per generar fluorescència durant la PCR, la qual cosa permet que la màquina de PCR en temps real controli la reacció en "temps real". El mètode SYBR Green es realitza mitjançant un colorant fluorescent anomenat SYBR green i detecta l'amplificació unint el colorant a l'ADN de doble cadena produït. Taqman es realitza mitjançant sondes de doble marca i detecta l'amplificació per degradació de la sonda per part de la polimerasa Taq i l'alliberament del fluoròfor. Aquesta és la diferència clau entre SYBR Green i Taqman.
Què és SYBR Green?
SYBR Green és un colorant fluorescent que s'utilitza per tenyir àcids nucleics, especialment ADN de doble cadena en biologia molecular. El mètode SYBR Green s'utilitza per quantificar els productes de PCR durant la PCR en temps real. Un cop s'uneix a l'ADN, el complex ADN-colorant resultant absorbeix la llum blava i emet una llum verda intensa. Succeeix a causa del canvi estructural que es produeix a la molècula del colorant en unir-se amb l'ADN de doble cadena. Quan la PCR crea més i més ADN, més molècules de colorant s'uneixen a l'ADN, generant més fluorescència. Per tant, la fluorescència augmenta amb l'acumulació de productes de PCR. Per tant, la quantitat de producte de PCR es pot mesurar quantitativament mitjançant la detecció de fluorescència SYBR Green.
El color verd SYBR també es pot utilitzar per a l'etiquetatge d'ADN en citometria i microscòpia fluorescent. El bromur d'etidi ha estat substituït amb èxit per SYBR Green ja que el bromur d'etidi és un colorant cancerígen amb problemes d'eliminació durant la visualització de l'ADN a l'electroforesi en gel.
El mètode verd SYBR té avantatges i desavantatges. Aquest mètode és molt sensible, barat i fàcil d'utilitzar. Tanmateix, a causa de la seva capacitat d'unir-se a qualsevol ADN de doble cadena, la unió inespecífica pot provocar una quantificació excessiva del producte de PCR.
Figura 01: tècnica verda SYBR
Què és Taqman?
Taqman és un mètode alternatiu a SYBR Green per supervisar el procés de PCR en temps real. Aquest mètode depèn de l'activitat exonucleasa 5'-3' de l'enzim polimerasa Taq per degradar les sondes durant l'extensió de la nova cadena i l'alliberament de fluoròfor. En aquest mètode s'utilitzen sondes de doble etiqueta i es basa en la hidròlisi de sondes. Les sondes són oligonucleòtids d'ADN marcats amb fluorescència que tenen una molècula reportera fluorescent (fluoròfor) a l'extrem 5' i una molècula extintor a l'extrem 3'. Estan dissenyats per unir-se a la plantilla monocatenària al costat oposat dels recuits d'imprimació. La polimerasa Taq afegeix nucleòtids a l'encebador i s'estén la nova cadena cap a les sondes de doble etiqueta. Una vegada que la polimerasa Taq es troba amb la sonda, l'acció de l'exonucleasa de la polimerasa Taq activa i degrada la sonda. Un cop completa la síntesi de la nova cadena, la sonda es sotmet a una degradació completa i allibera el fluoròfor. L'alliberament de fluoròfor genera fluorescència. La molècula quencher fluorescent apaga de manera eficient la llum emesa i crea la sortida per a la quantificació del producte de PCR. L'alliberament de fluoròfors i la quantitat de productes de PCR són proporcionals. Per tant, la quantificació es pot fer fàcilment mitjançant el mètode Taqman.
Figura 02: mètode Taqman
El mètode Taqman s'utilitza en PCR en temps real, quantificació de l'expressió gènica, detecció de polimorfismes genètics, quantificació de supressions d'ADN cromosòmic, identificació bacteriana, verificació de l'anàlisi de microarrays, genotipat SNP, etc.
Quina diferència hi ha entre SYBR green i Taqman?
SYBR Green contra Taqman |
|
| SYBR Green es basa en un colorant d'unió a l'ADN. | Taqman depèn de les sondes d'hibridació i de l'activitat exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa Taq. |
| sondes amb etiqueta fluorescent | |
| No calen sondes amb etiqueta fluorescent. | Son necessàries amb doble etiqueta. |
| Anàlisi de gens múltiplex | |
| No es pot utilitzar per a dianes genètiques multiplex. | Es pot utilitzar per a dianes de gens multiplex. |
| Cost | |
| Això és menys car. | Això és més car. |
| Especificitat | |
| Això és menys específic i s'uneix a qualsevol ADN de doble cadena | Aquests són molt específics, ja que les sondes detecten els productes d'amplificació específics. |
| Efectivitat | |
| Això és menys efectiu. | Això és molt efectiu. |
| Aplicació | |
| Això s'utilitza en PCR en temps real, visualització de gel d'agarosa, etiquetatge d'ADN, etc. | Això s'utilitza en PCR en temps real, quantificació de l'expressió gènica, detecció de polimorfismes genètics, etc. |
Resum: SYBR Green i Taqman
Taqman i SYBR green són dos mètodes utilitzats en la PCR en temps real (PCR quantitativa). Tots dos mètodes permeten quantificar el producte de PCR de manera eficient i es basen en l'emissió de la fluorescència. El mètode Taqman utilitza sondes de doble etiqueta per a la detecció de l'ADN acumulat, mentre que el mètode SYBR Green utilitza un colorant fluorescent. Tots dos mètodes també tenen aplicacions diferents en biologia molecular.
