Diferència clau: imprimació cap endavant i inversa
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és un mètode d'amplificació d'ADN que s'utilitza en aplicacions de biologia molecular. És una tècnica d'ús habitual que fa milions o milers de milions de còpies d'una seqüència d'ADN especialment interessada. És un mètode in vitro realitzat en laboratoris. La tècnica de PCR depèn totalment de l'ADN polimerasa produïda comercialment anomenada polimerasa Taq. I també requereix altres components i un manteniment adequat de la temperatura. Un component important són els primers. Els cebadors són seqüències curtes d'ADN dissenyades específicament per a la seqüència d'ADN objectiu. Solen tenir uns 20 nucleòtids de longitud. La polimerasa Taq catalitza l'addició de nucleòtids a la seqüència de nucleòtids preexistent. Per tant, els primers serveixen com a punts de partida de la síntesi de noves cadenes. La Taq polimerasa només funciona en la direcció de 5' a 3', per tant, la síntesi d'ADN es produeix en la mateixa direcció de 5' a 3'. Com que l'ADN és de doble cadena, es necessiten dos tipus d'encebadors en la PCR. Es coneixen com a imprimació directa i imprimació inversa. Els cebadors directes i inversos es denominen en funció de la direcció de l'allargament de l'encebador a l'ADN quan es produeix la síntesi d'ADN. L'encebador directe s'aconsegueix amb la cadena d'ADN antisentit i inicia la síntesi de la cadena +ve del gen en direcció 5' a 3'. L'imprimació inversa s'aconsegueix amb la cadena de sentit i inicia la síntesi de la cadena complementària de la cadena codificant; que és –ve la cadena del gen en direcció 5’ a 3’. Aquesta és la diferència clau entre els cebadors directes i inversos.
Què és un manual d'avantguarda?
L'orientació cap endavant és la síntesi de la cadena codificant o la cadena de sentit d'un gen. La polimerasa Taq catalitza la síntesi d'una nova cadena en direcció de 5' a 3'. La síntesi de la cadena codificant es produeix quan el cebador s'aconsegueix amb la cadena no codificant o antisentit i s'allarga en la direcció de 5' a 3'.
Figura 01: inicis directes i inversos
El cebador que s'aconsegueix amb la cadena antisentit o la cadena no codificant o la cadena de plantilla es coneix com a cebador directe ja que l'imprimació directe actua com a punt de partida per a la síntesi de codificació o la cadena positiva del gen. El cebador directe té una seqüència de nucleòtids curta que és complementària a l'extrem flanquejant 3' de la cadena antisentit. S'hibrida amb la cadena antisentit i facilita que la polimerasa Taq afegeixi nucleòtids complementaris a la cadena de plantilla.
Què és una imprimació inversa?
El cebador invers és la seqüència curta d'ADN que s'apropa amb l'extrem 3' de la cadena de sentit o la cadena de codificació. L'imprimació inversa serveix com a punt de partida per sintetitzar una cadena complementària de la seqüència codificant o la seqüència no codificant. L'imprimació inversa està dissenyada com a complement a l'extrem 3' de la cadena codificant. Per tant, es recobreix amb l'extrem 3' flanquejant de la cadena codificant i permet que la polimerasa Taq sintetitzi la cadena antisentit o la cadena de plantilla. Com que la seva orientació és inversa, aquesta imprimació està etiquetada com a imprimació inversa.
Tant els cebadors inversos com els directes són importants per a la producció de milions a milers de milions de còpies de regions concretes d'ADN que estan orientades o interessades.
Quines similituds hi ha entre la imprimació directa i inversa?
- Tant els cebadors directes com els inversos estan fets d'oligonucleòtids.
- Tant els cebadors directes com els inversos tenen una seqüència de nucleòtids curta complementària als extrems flanquejants de les cadenes dobles d'ADN.
- Tant els cebadors directes com els inversos solen estar formats per 20 nucleòtids.
- Tant els cebadors directes com els inversos s'utilitzen en reaccions en cadena de la polimerasa.
- Tant els imprimadors directes com els inversos es sintetitzen comercialment.
- Tant els imprimadors directes com els inversos són estables a la temperatura i normalment tenen una Tm similar.
- Tant els cebadors directes com els inversos estan recuits amb les seqüències d'ADN objectiu.
- Tant els cebadors directes com els inversos estan dissenyats segons les reaccions de PCR.
- Tant els cebadors directes com els inversos serveixen com a punts de partida per a l'amplificació de l'ADN.
- Tant els cebadors inversos com els directes són importants per a la producció de milions de còpies de regions particulars de seqüències d'ADN orientades o interessades.
Quina diferència hi ha entre la imprimació directa i inversa?
Primer avançat versus imprimació inversa |
|
| El cebador directe és la seqüència curta d'ADN que s'hibrida amb l'extrem 3' de la cadena no codificant o la cadena plantilla del gen i serveix com a punt de partida per sintetitzar la seqüència codificant. | El cebador invers és la seqüència curta d'ADN que s'hibrida amb l'extrem 3' de la cadena codificant o la cadena no plantilla i serveix com a punt de partida per sintetitzar la seqüència no codificant. |
| Fil de recuit | |
| Recuits d'imprimació cap endavant amb fil de plantilla. | Recuits d'imprimació inversa amb el fil sense plantilla. |
| Nova seqüència resultant | |
| Forward primer facilita la síntesi de la seqüència de codificació. | El cebador invers facilita la síntesi de la seqüència no codificant. |
Resum: inici cap endavant vs invers
Hi ha dos tipus d'encebadors implicats en la tècnica de PCR. Són cebadors directes i inversos. A partir de l'allargament del cebador en la síntesi de noves cadenes d'ADN, aquests cebadors s'etiqueten o s'anomenen. La polimerasa Taq sintetitza el nou ADN en una orientació de 5' a 3'. Per tant, els primers es dissenyen com a complementaris dels extrems 3' de les cadenes dobles. El cebador cap endavant que s'allarga en direcció 5' a 3' s'hibrida amb l'extrem 3' de l'antisentit o la plantilla o la seqüència no codificant. Serveix com a punt de partida per sintetitzar la seqüència de codificació. L'imprimació inversa que s'allarga en direcció 5' a 3' s'hibrida amb l'extrem 3' de la codificació o la no plantilla o la cadena de sentit. Serveix com a punt de partida per sintetitzar la seqüència no codificant. Aquesta és la diferència entre la imprimació directa i inversa.
