Diferència clau: tripsinització càlida i freda
La tripsinització càlida i freda són dos mètodes utilitzats en la desagregació enzimàtica de cèl·lules en el cultiu de cèl·lules animals. La diferència clau entre la tripsinització calenta i freda, com suggereixen els noms, depèn de la temperatura a la qual s'afegeix la tripsina per a la desagregació cel·lular. La tripsinització calenta té lloc en condicions de temperatura més alta (36,5 – 37 0C), mentre que la tripsinització en fred té lloc en condicions de baixa temperatura.
Durant el procés de cultiu de cèl·lules primàries de cèl·lules animals, s'utilitzen tres mètodes principals que han demostrat tenir èxit. Els tres mètodes inclouen la desagregació mecànica de les cèl·lules, la desagregació enzimàtica de les cèl·lules i la tècnica d'explant primari. La desagregació enzimàtica de les cèl·lules condueix a l'aïllament de les cèl·lules i es fa per l'enzim que degrada proteïnes tripsina. Per tant, aquest procés es coneix com a tripsinització. La tripsinització es pot fer en dues condicions diferents, la tripsinització calenta i la tripsinització en fred. La tripsinització calenta és el mètode de tractament de les cèl·lules amb tripsina en condicions càlides a una temperatura de 36,5-37 0C. La tripsinització en fred és el procés de tractament amb tripsina que té lloc en condicions més fredes, preferiblement en gel mantenint temperatures molt baixes.
Què és la tripsinització calenta?
La tripsinització es pot fer per desagregar els components cel·lulars per tal d'aïllar les cèl·lules per produir un cultiu cel·lular primari. La tripsina és un enzim de degradació de proteïnes i la barreja d'enzims utilitzada en la tripsinització pot ser un extracte brut o un producte purificat. Es diu que l'extracte brut és més eficient en la lisi de proteïnes i la desintegració cel·lular, ja que conté altres enzims degradatius.
La tripsinització calenta és el mètode enzimàtic més utilitzat per a la desagregació cel·lular que té lloc en condicions de temperatura més alta. Abans del tractament per tripsinització, el teixit desitjat es talla en trossos més petits. Facilita el fàcil procés de desagregació. A continuació, el teixit picat es renta en un medi especial conegut com a medi de sal basal de dissecció.
Un cop finalitzat el pas de rentat, les cèl·lules es transformen en un matràs que conté l'enzim actiu, que és la tripsina. Com que aquesta tècnica implica un protocol de tripsinització calenta, la tripsina es col·loca a una temperatura d'uns 37 0C durant unes quatre hores.
Figura 01: tripsina
Els continguts es barregen i s'agiten utilitzant mètodes de centrifugació per facilitar el protocol i per accelerar el procés de desagregació. Un cop assolit el temps recomanat, les cèl·lules es poden derivar del sobrenedant. Les cèl·lules derivades del sobrenedant s'incuben a una temperatura i un temps determinats.
Què és la tripsinització en fred?
La tripsinització en fred és l' altre tipus de tripsinització que té lloc en condicions fredes. En aquesta tècnica, les cèl·lules que es tallen i es renten es posen en vials sobre gel i després es remullen amb tripsina. El període de remull és molt més llarg: entre 6 i 24 hores.
Un cop finalitzat el procediment de remull, la tripsina s'elimina del lisat cel·lular i les peces de teixit s'incuben a 37 0C durant uns 20-30 minuts. La desagregació de les cèl·lules es produeix mitjançant pipetes repetides de la barreja de teixits. Això permetrà que les cèl·lules es dissociïn de la membrana i arribin al sobrenedant. Un cop les cèl·lules estan al sobrenedant, s'incuben i es fan créixer a la temperatura i el període de temps desitjats.
El mètode de tripsinització en fred té diversos avantatges
- Major rendiment de cèl·lules viables a mesura que es minimitza el dany cel·lular. El dany cel·lular es minimitza si no s'utilitzen passos de centrifugació.
- Mètode molt convenient.
- Menys laboriós.
La principal limitació del mètode de tripsinització en fred és que no es poden utilitzar grans quantitats en un sol cas.
Quines similituds hi ha entre la tripsinització càlida i la freda?
- Tant els processos de tripsinització en fred com en calent utilitzen l'enzim tripsina per a la desagregació de les cèl·lules.
- Els processos de tripsinització en fred i en calent s'utilitzen en els procediments de cultiu cel·lular per a la desagregació de cèl·lules.
- Tant en els procediments de tractament de tripsinització en fred com en calent, les cèl·lules es deriven del sobrenedant.
Quina diferència hi ha entre la tripsinització calenta i la freda?
Tripsinització càlida vs freda |
|
| La tripsinització calenta és el mètode per tractar les cèl·lules amb tripsina en condicions càlides a una temperatura de 36,5-37 0. | La tripsinització en fred és el procés de tractament de la tripsina que té lloc en condicions més fredes, preferiblement en gel mantenint temperatures molt baixes. |
| Protocol | |
| Els trossos de teixit picat es mantenen a 37 0C contínuament durant tot el procediment. | Els trossos de teixit picat es mantenen inicialment a temperatures gelades i després es mantenen a 37 0. |
| Temperatura | |
| La tripsinització càlida es produeix entre els 36,5 i els 37 0 | La tripsinització en fred es produeix a temperatures gelades. |
| Temps consumit | |
| Menor temps necessari per a tot el procés (unes 4 hores) de tripsinització calenta. | Es requereix un temps més llarg (entre 6 i 24 hores) per a la tripsinització en fred. |
| Rendiment de cèl·lules viables | |
| Baixa tripsinització càlida. | Alta tripsinització en fred. |
| Ús de la centrifugació | |
| La centrifugació és necessària per a la desagregació de cèl·lules en tripsinització càlida. | La centrifugació no és necessària en la tripsinització en fred. |
| Quantitat inicial de teixit per a la tripsinització | |
| Es pot utilitzar una quantitat més gran de teixit en la tripsinització calenta. | Es pot utilitzar una quantitat menor de teixit en la tripsinització en fred. |
| Dany cel·lular | |
| Alt a causa de la centrifugació en tripsinització càlida. | Menys a causa de la tripsinització en fred. |
Resum: tripsinització càlida vs freda
La tripsinització és el mètode d'utilitzar l'enzim que degrada proteïnes tripsina per a la desagregació i la preparació de cultius de cèl·lules primàries durant el procés de cultiu cel·lular. Hi ha dues tècniques principals de tripsinització basades en les temperatures utilitzades durant el procediment. Són tripsinització càlida i freda. La tripsinització calenta es realitza a 37 0C, mentre que la tripsinització en fred es porta a terme en condicions de gel. Tot i que la tripsinització en fred triga més temps a completar-se, es diu que té un major rendiment de cèl·lules viables. Això es deu al fet que el dany cel·lular es minimitza en la tripsinització en fred, ja que no utilitza passos de centrifugació vigorosos. Aquesta és la diferència entre la tripsinització càlida i la freda.
