Diferència clau: microarrays i seqüenciació d'ARN
El transcriptoma representa tot el contingut d'ARN present en una cèl·lula, incloent l'ARNm, l'ARNr, l'ARNt, l'ARN degradat i l'ARN no degradat. El perfil del transcriptoma és un procés important per entendre els coneixements cel·lulars. Hi ha diversos mètodes avançats per al perfil de transcriptoma. La seqüenciació de microarrays i ARN són dos tipus de tecnologies desenvolupades per analitzar el transcriptoma. La diferència clau entre la seqüenciació de microarrays i ARN és que la microarray es basa en el potencial d'hibridació de sondes marcades predissenyades amb seqüències d'ADNc objectiu, mentre que la seqüenciació d'ARN es basa en la seqüenciació directa de cadenes d'ADNc mitjançant tècniques de seqüenciació avançades com NGS. La microarray es realitza amb el coneixement previ sobre les seqüències i la seqüenciació d'ARN es realitza sense els coneixements previs sobre les seqüències.
Què és Microarray?
Microarray és un mètode robust, fiable i d' alt rendiment utilitzat pels científics per a l'elaboració de perfils de transcriptoma. És l'enfocament més popular per a l'anàlisi de transcripcions. És un mètode de baix cost, que depèn de les sondes d'hibridació.
La tècnica comença amb l'extracció d'ARNm de la mostra i la construcció d'una biblioteca d'ADNc a partir de l'ARN total. A continuació, es barreja amb sondes predissenyades marcades fluorescentment sobre una superfície sòlida (matriu puntual). Les seqüències complementàries s'hibriditzen amb les sondes marcades del microarray. A continuació, es renta el microarray i es filtra i es quantifica la imatge. Les dades reunides s'han d'analitzar per obtenir els perfils d'expressió relatius.
La intensitat de les sondes de microarrays s'assumeix que és proporcional a la quantitat de transcripcions de la mostra. Tanmateix, la precisió de la tècnica depèn de les sondes dissenyades, del coneixement previ de la seqüència i de l'afinitat de les sondes per a la hibridació. Per tant, la tecnologia de microarrays té limitacions. La tècnica de microarrays no es pot realitzar amb transcripcions de baixa abundància. No aconsegueix diferenciar isoformes i identificar variants genètiques. Com que aquest mètode depèn de la hibridació de sondes, alguns problemes relacionats amb la hibridació, com ara la hibridació creuada, la hibridació inespecífica, etc., es produeixen en la tècnica de microarrays.
Figura 01: Microarray
Què és la seqüenciació d'ARN?
La seqüenciació d'escopeta d'ARN (ARN seq) és una tècnica de seqüenciació de transcriptoma sencer desenvolupada recentment. És un mètode ràpid i d' alt rendiment de perfil de transcriptoma. Quantifica directament l'expressió dels gens i dóna lloc a una investigació profunda del transcriptoma. La seqüència d'ARN no depèn de sondes predissenyades ni del coneixement previ de les seqüències. Per tant, el mètode ARN seq té una gran sensibilitat i capacitat per detectar nous gens i variants genètiques.
El mètode de seqüenciació de l'ARNes realitza mitjançant diversos passos. L'ARN total de la cèl·lula ha d'estar aïllat i fragmentat. A continuació, utilitzant la transcriptasa inversa, s'ha de preparar una biblioteca d'ADNc. Cada cadena d'ADNc ha d'estar lligada amb adaptadors. Després s'han d'amplificar i purificar els fragments lligats. Finalment, utilitzant un mètode NGS, s'ha de realitzar la seqüenciació de l'ADNc.
Figura 02: Seqüenciació de l'ARN
Quina diferència hi ha entre la seqüenciació de microarrays i d'ARN?
Microarray vs seqüenciació d'ARN |
|
| Microarray és un mètode robust, fiable i d' alt rendiment. | La seqüenciació d'ARN és un mètode precís i d' alt rendiment. |
| Cost | |
| Aquest és un mètode de baix cost. | Aquest és un mètode car. |
| Anàlisi d'un gran nombre de mostres | |
| Això facilita l'anàlisi d'un gran nombre de mostres simultàniament. | Això facilita l'anàlisi d'un gran nombre de mostres. |
| Anàlisi de dades | |
| L'anàlisi de dades és complex. | En aquest mètode es generen més dades; per tant, el procés és més complex. |
| Coneixement previ de seqüències | |
| Aquest mètode es basa en sondes d'hibridació, per la qual cosa és necessari un coneixement previ de les seqüències. | Aquest mètode no depèn del coneixement previ de la seqüència. |
| Variacions estructurals i gens novells | |
| Aquest mètode no pot detectar variacions estructurals ni gens nous. | Aquest mètode pot detectar variacions estructurals com ara la fusió de gens, l'empalmament alternatiu i gens nous. |
| Sensibilitat | |
| Això no pot detectar diferències en l'expressió de les isoformes, de manera que té una sensibilitat limitada. | Això té una alta sensibilitat. |
| Resultat | |
| Això només pot donar lloc a nivells d'expressió relatius. Això no proporciona una quantificació absoluta de l'expressió gènica. | Ofereix nivells d'expressió absoluts i relatius. |
| Reanàlisi de dades | |
| Això s'ha de tornar a executar per tornar a analitzar. | Les dades de seqüenciació es poden reanalitzar. |
| Necessitat de personal específic i d'infraestructura | |
| No es requereix una infraestructura ni personal específics per a microarrays. | Infraestructura i personal específics necessaris per a la seqüenciació d'ARN. |
| Problemes tècnics | |
| La tècnica de microarrays té problemes tècnics com ara la hibridació creuada, la hibridació no específica, la taxa de detecció limitada de sondes individuals, etc. | La tècnica RNA seq evita problemes tècnics com ara la hibridació creuada, la hibridació no específica, la taxa de detecció limitada de sondes individuals, etc. |
| Prejudicis | |
| Aquest és un mètode esbiaixat ja que depèn de la hibridació. | El biaix és baix en comparació amb el microarray. |
Resum: microarrays i seqüenciació d'ARN
Els mètodes de seqüenciació de microarrays i ARN són plataformes d' alt rendiment desenvolupades per al perfil de transcriptoma. Tots dos mètodes produeixen resultats que estan altament correlacionats amb els perfils d'expressió gènica. No obstant això, la seqüenciació de l'ARN té avantatges sobre els microarrays per a l'anàlisi de l'expressió gènica. La seqüenciació d'ARN és un mètode més sensible per a la detecció de transcripcions de baixa abundància que els microarrays. La seqüenciació de l'ARN també permet la diferenciació entre isoformes i la identificació de variants gèniques. No obstant això, la microarray és l'opció habitual de la majoria dels investigadors, ja que la seqüenciació d'ARN és una tècnica nova i cara amb reptes d'emmagatzematge de dades i anàlisi de dades complexa.
