Diferència clau: clonació de gens vs PCR
La síntesi de moltes còpies d'ADN a partir d'un fragment d'ADN específic s'anomena amplificació d'ADN. Hi ha dos processos principals d'amplificació de l'ADN, la clonació de gens i la PCR. La diferència clau entre la clonació gènica i la PCR és que la clonació gènica produeix les múltiples còpies d'un gen específic in vivo mitjançant la construcció d'un ADN recombinant i creixent dins d'un bacteri hoste, mentre que la PCR produeix milions de còpies d'un fragment d'ADN específic in vitro sotmesos a cicles repetits de desnaturalització i síntesi.
Què és la clonació de gens?
La clonació gènica és una tècnica emprada per localitzar i multiplicar un gen específic de l'ADN genòmic extret d'un organisme mitjançant la construcció d'ADN recombinant. L'ADN genòmic conté milers de gens diferents codificats per proteïnes. Quan s'extreu l'ADN, inclou tots els gens possibles que pot suportar. La tècnica de clonació gènica ha permès la detecció d'un gen específic a partir de l'ADN total. Per tant, la clonació de gens serveix com una eina important en biologia molecular.
La creació d'una biblioteca genòmica d'un organisme és essencial en la clonació de gens si no hi ha cap pista sobre la ubicació del gen rellevant a l'ADN. Es crea una biblioteca genòmica seguint els passos següents.
Pas 1: extracció de l'ADN total d'un organisme que conté el gen desitjat.
Pas 2: restricció de la digestió de l'ADN extret per produir petits fragments manejables. Aquest pas es veu facilitat per les endonucleases de restricció.
Pas 3: Selecció d'un vector adequat i obertura de l'ADN del vector utilitzant les mateixes endonucleases de restricció. Els plasmidis bacterians s'utilitzen habitualment com a vectors per transportar ADN estrany. Els plasmidis són petits cercles d'ADN situats dins dels bacteris.
Pas 4: combinació de l'ADN vectorial i l'ADN fragmentat per produir una molècula d'ADN recombinant. Aquest pas es regeix per l'ADN lligasa.
Pas 5: transferència de molècules d'ADN recombinant a bacteris hostes. Aquest pas es coneix com a transformació i es fa mitjançant un xoc tèrmic.
Pas 5: cribratge de cèl·lules bacterianes transformades en un medi de cultiu. Al final del procés de transformació s'obté una població mixta de cèl·lules hostes transformades i no transformades. Com que el gen d'interès inclou només en cèl·lules hostes transformades. Per tant, cal seleccionar cèl·lules transformades. La selecció es fa amb medis selectius que contenen antibiòtics. Només les cèl·lules transformades creixen en aquest medi de cribratge que permet la selecció.
Pas 6: creixement de bacteris per produir una biblioteca de gens. En aquest pas, les cèl·lules hoste transformades s'introdueixen en un medi de cultiu fresc que proporciona els requisits de creixement òptims. Les colònies totals de les plaques de cultiu representen la biblioteca genòmica d'aquest organisme.
Pas 7: la molècula d'ADN recombinant que conté el gen d'interès s'ha de seleccionar a partir de milers de fragments clonats d'ADN recombinant. Es pot aconseguir mitjançant l'ús de sondes que marquen el gen específic o els resultats de la proteïna específica d'aquest gen.
Un cop identificat el gen interessat que conté la colònia bacteriana del total de colònies, és possible fer milions de còpies del plasmidi recombinant que conté el gen.
La clonació de gens s'utilitza per establir biblioteques de gens, produir proteïnes especials, vitamines, antibiòtics, hormones, seqüenciar i mapejar genomes dels organismes, fer múltiples còpies de l'ADN d'individus en medicina forense, etc.
Figura_1: clonació de gens
Què és la PCR?
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica que genera un gran nombre de còpies d'un fragment d'ADN concret. L'amplificació exponencial d'una seqüència específica d'ADN s'obté per PCR en condicions in vitro. Aquesta tècnica és una eina molt potent en Biologia Molecular, ja que pot multiplicar una petita mostra d'ADN en una quantitat útil. La PCR va ser introduïda per Kary Mullis l'any 1983 i aquesta invenció guanyadora de premis va suposar un gran avenç en la biologia molecular.
La tècnica
PCR segueix reaccions PCR repetides, tal com es mostra a la figura 02. Una reacció de PCR consta de tres passos principals que tenen lloc a tres temperatures diferents; desnaturalització de doble cadena a l'ADN a 94 0C, recuit dels primers a 68 0C i allargament de la cadena a 72 0 C. Per tant, quan es realitza la PCR, la fluctuació de temperatura s'ha de mantenir altament per a una replicació adequada. La PCR es realitza en una màquina de PCR dins de tubs de PCR. Els tubs de PCR es carreguen amb les barreges de PCR correctes que contenen DNA plantilla, polimerasa Taq, primers, dNTPs i tampó. La desnaturalització de l'ADN de mostra de doble cadena en ADN de cadena simple es fa trencant els enllaços d'hidrogen entre bases complementàries a 94-98 0C. A continuació, s'exposen cadenes simples d'ADN plantilla per als cebadors. S'han de proporcionar un parell d'imprimadors (davant i invers) i han de ser termoestables per tolerar altes temperatures. Els cebadors són seqüències d'ADN curtes d'una sola cadena complementàries als extrems del fragment d'ADN objectiu. En la PCR s'utilitzen primers sintètics. Els cebadors s'uneixen a les bases complementàries de l'ADN de la mostra i inicien la síntesi d'una nova cadena. Aquest pas és catalitzat per un enzim anomenat Taq polimerasa; un enzim d'ADN polimerasa termoestable aïllat de Thermus auqaticus. Quan els cebadors i els nucleòtids (blocs de construcció) estan disponibles, la polimerasa Taq construeix la nova cadena d'ADN complementària a l'ADN plantilla. Al final del programa de PCR, s'observa un fragment d'ADN amplificat mitjançant electroforesi en gel. Si es requereix una anàlisi addicional, el producte de PCR es purifica del gel.
PCR és molt útil per al diagnòstic i seguiment de mal alties genètiques i adquirides, identificació de delinqüents (en l'àmbit de la medicina forense), estudi de l'estructura i funció d'un segment d'ADN objectiu, seqüenciació i mapeig de genomes d'organismes, etc. La PCR s'ha convertit en una tècnica de laboratori rutinària als laboratoris d'investigació de biologia mèdica i molecular entre els científics, ja que té una gran varietat d'aplicacions.
Figura_2: Reacció en cadena de la polimerasa
Quina diferència hi ha entre la clonació de gens i la PCR?
Clonació de gens vs PCR |
|
| La clonació de gens és el procés de fer múltiples còpies d'un gen específic in vivo mitjançant ADN recombinant i transformar-se en un bacteri hoste. | La tècnica de PCR produeix múltiples còpies d'una seqüència d'ADN concreta in vitro mitjançant cicles repetits de reaccions de PCR. |
| Requisit per a la construcció d'ADN recombinant | |
| Es produeix ADN recombinant per localitzar el gen. | No es produeix DNA recombinant. |
| Necessitat de mà d'obra | |
| Aquest procés requereix molta mà d'obra. | La mà d'obra intensiva no és necessària. |
| Procés in vivo o in vitro | |
| La construcció de l'ADN recombinant és in vitro i l'amplificació de l'ADN és in vivo. | L'amplificació de l'ADN es produeix completament in vitro. |
Resum: clonació de gens vs PCR
La clonació de gens i la PCR són dos mètodes utilitzats per a l'amplificació de l'ADN. La PCR és un procés in vitro que fa múltiples còpies d'ADN d'un fragment d'ADN concret sense utilitzar ADN recombinant i un organisme hoste. La clonació de gens és principalment un procés in vivo que dóna lloc a múltiples còpies d'un gen interessat dins de l'organisme hoste mitjançant la construcció d'ADN recombinant. Aquesta és la diferència entre la clonació de gens i la PCR.
