La diferència clau entre Golden Gate i Gibson Assembly és que Golden Gate es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència determinada per clonar, mentre que Gibson Assembly no es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència determinada per ser clonat.
Durant les últimes dècades, els científics moleculars han desenvolupat diversos procediments estandarditzats que permeten el muntatge més fàcil de diversos fragments d'ADN en una sola peça. Per tant, els mètodes de clonació com ara la lligadura d'enzims de restricció, la clonació de passarel·la, el muntatge Gibson, el muntatge Golden Gate i la clonació TOPO són àmpliament utilitzats pels investigadors en experiments científics. Per tant, Golden Gate i Gibson Assembly són dos mètodes de clonació molecular que permeten l'acoblament de diversos fragments d'ADN en una sola peça.
Què és el Golden Gate Assembly?
Golden Gate és un mètode de clonació molecular que facilita l'acoblament de múltiples fragments d'ADN en una sola peça. Aquest mètode es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència particular per clonar. Es va originar l'any 1996. Aquesta tècnica utilitza enzims de restricció de tipus IIS i ADN lligasa T4. Aquests enzims tallen l'ADN fora dels llocs de reconeixement. Poden crear voladissos no palindròmics. Per tant, es poden reunir diversos fragments d'ADN mitjançant combinacions de seqüències de sobresort.
Figura 01: Golden Gate
Procediment de muntatge de la Golden Gate
La tècnica Golden Gate té tres passos principals en el seu procediment:
- creació de voladissos en el vector de clonació,
- conjunt de múltiples insercions d'ADN mitjançant l'ús de seqüències específiques de fragments en voladissos, i
- ligation.
El conjunt Golden Gate utilitza vectors de clonació circulars (vector de destinació). A més, en aquest mètode, el lloc de restricció s'elimina del producte lligat per dur a terme la digestió i la lligadura simultàniament. Un protocol de cicle tèrmic típic per a Golden Gate oscil·la entre 37 °C i 16 °C perquè 37 °C és òptim per als enzims de restricció i 16 °C és òptim per a lligases.
Què és Gibson Assembly?
Gibson Assembly és un mètode de clonació molecular que permet l'acoblament de diversos fragments d'ADN en una sola peça. A diferència del mètode Golden Gate, aquest mètode no depèn de la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència determinada per clonar. Va ser trobat per Daniel G. Gibson de l'Institut J. Craig Venter. Aquesta tècnica és un tipus de mètode de clonació independent de seqüències i lligasa (SLIC).
Figura 02: muntatge de Gibson
Procediment de muntatge de Gibson
Gibson Assembly necessita fragments d'ADN que continguin 20-40 parells de bases que es superposen amb fragments d'ADN adjacents. S'afegeixen superposicions mitjançant PCR. A continuació, aquests fragments d'ADN s'afegeixen a la barreja de màser Gibson que té tres enzims. Aquest procediment es realitza en condicions isotèrmiques (50 °C durant 1 hora) utilitzant tres enzims diferents: exonucleasa, ADN polimerasa i ADN lligasa. L'exonucleasa mastega l'ADN des de l'extrem 5'. Per tant, no inhibeix l'activitat de la polimerasa i permet que la reacció continuï en un sol procés. Les regions monocatenaris resultants dels fragments d'ADN adjacents es poden recuit a causa de seqüències de superposició. L'ADN polimerasa omple els buits afegint nucleòtids. Finalment, l'ADN lligasa s'uneix covalentment a l'ADN dels segments adjacents. Normalment, Gibson Assembly utilitza vectors de destinació linealitzats. A més, aquest mètode pot combinar simultàniament fins a 15 fragments d'ADN basats en la similitud de seqüències.
Similituds entre Golden Gate i Gibson Assembly
- Golden Gate i Gibson Assembly són dos mètodes de clonació molecular.
- Ambdós mètodes poden reunir diversos fragments d'ADN en una sola peça.
- Aquests mètodes utilitzen vectors de destinació.
- Ambdós mètodes utilitzen termocicladors per a l'acoblament de diversos fragments d'ADN.
- S'utilitzen en la mutagènesi dirigida al lloc.
Diferència entre Golden Gate i Gibson Assembly
Golden Gate és un mètode de clonació molecular que s'utilitza en l'acoblament de múltiples fragments d'ADN en una sola peça que es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència determinada per clonar, mentre que Gibson Assembly és un mètode de clonació molecular utilitzat en el assemblatge de múltiples fragments d'ADN en una sola peça sense dependre de la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència determinada per clonar. Aquesta és la diferència clau entre Golden Gate i Gibson Assembly. A més, el mètode Golden Gate utilitza un vector de destinació circular, mentre que el mètode Gibson Assembly utilitza un vector de destinacions linealitzat.
La infografia següent mostra la diferència entre Golden Gate i Gibson Assembly.
Resum: Golden Gate vs Gibson Assembly
La clonació molecular és un mètode utilitzat per reunir molècules d'ADN recombinant i dirigir la seva replicació dins dels organismes hoste. Golden Gate i Gibson Assembly són dos mètodes de clonació molecular que permeten l'acoblament de múltiples fragments d'ADN en una sola peça. El mètode Golden Gate es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència particular per clonar, mentre que Gibson Assembly no es basa en la presència de llocs de restricció dins d'una seqüència particular per clonar. Per tant, aquesta és la diferència clau entre Golden Gate i Gibson Assembly.
